王宏栋，徐国锋，矫薇薇，张秀英

(东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030)



猪源氟喹诺酮耐药大肠杆菌通过接合水平传递耐药性的研究

王宏栋，徐国锋，矫薇薇，张秀英*

(东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030)

摘要：为研究猪源大肠杆菌中可移动质粒在氟喹诺酮类药物耐药性水平传播机制中的作用，作者对氟喹诺酮耐药且PMQR基因阳性的大肠杆菌进行接合试验，并对所得接合子采用微量肉汤稀释法测定其对8种常见药物的最小抑菌浓度(MIC)，针对质粒介导的氟喹诺酮耐药基因(PMQR)设计特异性引物对接合子进行PCR扩增。研究结果显示，41株氟喹诺酮耐药且PMQR基因阳性的供体菌共接合成功16株细菌，接合成功率高达39%，接合子与受体菌J53相比，均呈现一定的耐药表型，与供体菌相比，87.5%的接合子存在耐药谱型的变化，并且存在丢失一种药物耐药性，产生另一种药物耐药性的现象，PCR结果显示，接合子与供体菌相比，基因型有所减少，接合子中qnrS基因接合成功率最高，12.5%的接合子发生oqxA、oqxB和qnrS的共转移。本研究表明不同的PMQR基因在可移动质粒介导耐药性水平传播的过程中接合成功率存在差异，不同的PMQR基因有可能位于不同的可移动质粒上，通过比较接合前后供体菌和受体菌耐药表型的变化，尤其是PMQR基因检出率的变化，可以初步确定，可移动性质粒在大肠杆菌耐药性水平传播的过程中起到了非常重要的作用。

关键词：大肠杆菌；质粒；接合子；水平传播

随着畜牧养殖业的迅速发展，各种抗生素和化学抗菌剂也不断得到开发利用，在其为人类做出突出贡献的同时，细菌耐药性现象也越发严重，尤其是R质粒的发现，证实了在遗传物质含有天然耐药基因的同时，细菌迫于生存压力，也可产生获得性耐药性[1]，这就造成了耐药性不仅可以垂直传播，也存在细菌种内甚至种间的耐药性传递，即水平传播。作者通过接合试验，比较接合前后大肠杆菌耐药表型和基因型的变化，从而探讨可移动质粒在耐药性传播过程中所发挥的作用。

1材料与方法

1.1试验材料

大肠杆菌质控菌株ATCC 25922购自中国兽医药品监察所；大肠杆菌临床分离株分离自哈尔滨市周边规模化养猪场猪肛拭子(冰盒保存)；受体菌为大肠杆菌J53，购自中国科学院微生物研究所，不含质粒，对叠氮钠耐药，对大多数药物敏感。试剂：BA(Blood-Agar)琼脂，麦康凯培养基、伊红美蓝培养基等试验用培养基以及肠杆菌科生化鉴定管等均购自杭州天和微生物试剂有限公司；2×Tap PCR Mix、DL2000 DNA Marker购自TaKaRa公司。药品：叠氮钠、庆大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、恩诺沙星(ENR)、环丙沙星(CIP)、头孢曲松(CRO)、头孢曲松-舒巴坦(CRO-SCF)、多西环素(DOX)、氟苯尼考(FLO)均购自北京天坛药物生物技术开发公司。

1.2接合试验

接合试验方法参考膜过滤接合法(filter mating method)[2]，即分别将25 μL供体菌和受体菌的LB培养液接种于25 μL含有环丙沙星(4 μg·μL-1，前期试验证明J53对其敏感)和叠氮钠(150 μg·μL-1，全部供体菌敏感)的LB肉汤中，37 ℃培养4～5 h，当其OD600 nm达到0.6时，分别取0.5 mL供体菌和受体菌菌悬液加入到4 mL LB肉汤中，再将混合物用φ 0.45 μm的无菌滤膜过滤，带菌滤膜置一BA平板表面，37 ℃培养3～4 h后，用1 mL LB肉汤重悬菌体。细菌混合物适当稀释后，分别取50 μL稀释液涂布于同时含有环丙沙星(4 μg·mL-1)和叠氮钠(150 μg·mL-1)的BA平板，同时分别取等量受体菌和供体菌菌悬液同法处理，37 ℃培养过夜。挑取培养后平板上单菌落并转移至麦康凯平板，然后确定接合子对相应抗生素的药敏性、抗性基因的转移及接合效率[3]。

1.3疑似接合子的鉴定

挑取上述含药平板上的疑似接合子单菌落于LB肉汤中(其中含4 μg·μL-1的环丙沙星和150 μg·μL-1的叠氮钠)进行培养，提取DNA，进行ERIC-PCR鉴定，参考文献[4]设计引物，ERIC-1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；ERIC-2：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，比较与J53是否一致，最终在含药平板和含药LB肉汤中生长且ERIC条带和J53相同的菌液确定为接合子，并且用30%的甘油进行保存。

1.4接合子PMQR基因型及耐药表型的检测

根据GenBank已知序列和参考文献[5]设计9对特异性引物，由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，各组PCR所用引物及扩增长度见表1。取上述已证明成功接合的接合子DNA进行PMQR-PCR检测，并将阳性扩增产物，选取部分送英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序，利用NCBI blast程序在GenBankTM中对目的基因序列进行同源检索分析，观察是否发生了耐药基因的水平转移。采用美国临床实验室标准化委员会(CLSI)所推荐的微量肉汤稀释法对接合子菌液进行药敏试验[6]，并根据CLSI标准进行药物敏感性判断，药敏试验结果与供体菌、受体菌进行比较。

表1PCR引物序列

Table 1Sequences of primers used for PCR

基因Gene引物序列(5'-3')Primersequences(5'-3')产物长度/bpProductlengthqnrAF:TCAGCAAGAGGATTTCTCA627R:GGCAGCACTATTACTCCCAqnrBF:CCTGAGCGGCACTGAATTTAT617R:GTTTGCTGCTCGCCAGTCGAqnrSF:ACGACATTCGTCAACTGCAA417R:TAAATTGGCACCCTGTAGGCqnrCF:GGGTTGTACATTTATTGAATC447R:TCCACTTTACGAGGTTCTqnrDF:CGAGATCAATTTACGGGGAATA582R:AACAAGCTGAAGCGCCTGaac(6')-IbF:TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTA482R:CTCGAATGCCTGGCGTGTTTqepAF:AACTGCTTGAGCCCGTAGAT596R:GTCTACGCCATGGACCTCACoqxAF:GCGTCTCGGGATACATTGAT482R:GGCGAGGTTTTGATAGTGGAoqxBF:CTGGGCTTCTCGCTGAATAC498R:CAGGTACACCGCAAACACTG

2结果

2.1接合试验

41株氟喹诺酮耐药且PMQR基因阳性的供体菌共接合成功16株细菌，接合成功率高达39%，ERIC-PCR电泳结果如图1。

2.2药敏试验

16株接合成功的大肠杆菌对8种抗菌药物的敏感性测定结果如表2和图2，从中可以看出接合前后，与供体菌相比，对头孢噻呋、阿米卡星、庆大霉素、氟苯尼考以及多西环素的耐药性均发生了转移，16株接合成功的大肠杆菌中，12.5%的接合子耐药谱型没有发生变化，12.5%的接合子耐药谱型变宽，68.75%的接合子发生了耐药谱型变窄，本试验中一株接合子菌株还发生了丢失一种药物耐药性的同时，产生对另一种药物耐药的现象；与受体菌相比，接合子均表现出一定的耐药表型(受体菌E.coliJ53对上述临床常见药物均敏感)。

M.DL2000 DNA相对分子质量标准；1.阴性对照；2～13.基因片段产物M.DL2000 DNA marker；1.Negative control；2-13.Partial segment of qnrS gene product band图1　ERIC-PCR电泳结果Fig.1　The results of ERIC-PCR

表216株供体菌与其接合子耐药表型

Table 2Drug resistance phenotypes of donor strains and transconjugants

供体菌Donorstrain接合子TransconjugantH1CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-FLOCRO-CEF-CIP-ENR-FLOH3CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-DOX-FLOCRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-DOX-FLOH5CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-FLOCRO-CEF-CIP-ENR-FLOH6CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-FLOCRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-DOX-FLOH9CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-DOX-FLOCRO-CEF-GEN-CIP-ENR-DOX-FLOH10CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-DOX-FLOCRO-CEF-GEN-CIP-ENR-DOX-FLOH18AMK-GEN-CIP-ENR-FLOCIP-ENR-FLOH21CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-FLOCRO-CEF-CIP-ENR-FLOH32CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-FLOCRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-FLOH40CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-FLOCRO-CEF-CIP-ENR-FLOH47CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-FLOCRO-CEF-CIP-ENR-FLOH48CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-FLOCRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-DOX-FLOH53CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-FLOCRO-CEF-GEN-CIP-ENR-DOX-FLOH63CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-DOX-FLOCRO-CEF-CIP-ENR-FLOH69CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-FLOCRO-CEF-CIP-ENR-FLOH74CRO-CEF-AMK-GEN-CIP-ENR-DOX-FLOCRO-CIP-ENR-FLO

图2　16株供体菌与其接合子对8种抗菌药物多重耐药情况Fig.2　Multiple drug resistance of 16 strains of donors and transconjugants to 8 kinds of antimicrobial agents

2.3接合子PMQR基因检测结果

通过对接合子进行PMQR-PCR检测、测序、Blast比对，最终发现，16株接合子中全部检测到了PMQR基因，并且对接合子进行了ERIC-PCR，结果显示接合子均为E.coliJ53，供体菌与接合子的PMQR基因检出率和基因分型结果见表3和表4，从中可以看出qnrS基因全部接合成功，qepA和aac-Ib-cr未接合成功，11株含oqxA和oqxB的供体菌中，oqxA和oqxB接合成功率为45.5%，在8株oqxA、oqxB和qnrS共存在的供体菌中，25%的接合子发生了oqxA、oqxB和qnrS的共转移。

表316株供体菌与其接合子PMQR基因检出率

Table 3The detection rate of PMQR genes of 16 strains of donors and transconjugants

基因型Genetype供体菌Donorstrain接合子TransconjugantoqxA115oqxB115qnrS1313aac-Ib-cr10qepA10

3讨论

在过去相当长的一段时间里，人们一直认为细菌对氟喹诺酮类耐药机制主要是由染色体耐药决定区[6](quinolone resistance determining regions，QRDRs)突变造成的，并通过自我复制垂直传递给子代，但是这却不能解释临床上耐药性在不同细菌平行传播的现象，随着研究的深入，不断有学者研究发现和报道了质粒介导的氟喹诺酮类耐药基因，即PMQR，虽然这种质粒介导的PMQR耐药机制仅仅是处于低水平的，但是多基因型的携带以及与染色体耐药决定区的相互配合，却能有利于筛选出具有更高耐药性的菌株[7]，截止到目前为止，已有三大类PMQR基因[qnr、aac(6′)-Ib-cr、qepA]在世界范围内报道[8]，R质粒的发现，则证实了在遗传物质含有天然耐药基因的同时，细菌迫于生存压力，也可产生获得性耐药性，因此R质粒在细菌间的水平传播是细菌产生获得性耐药机制的关键途径。本试验中肠杆菌J53具有叠氮钠抗性，且对绝大多数抗菌药物极为敏感，J53作为受体菌与PMQR基因阳性临床耐药菌株共培养，并通过氟喹诺酮类药物和叠氮钠共同筛选，以及ERIC-PCR验证，最终得到了16株接合子，接合成功率高达39%，这与本课题组前期的试验结果[9]相符合，这也充分说明在自然状态下，质粒非常容易地在不同大肠杆菌之间转移，使耐药性的传播更加便捷[10-12]，为临床上的治疗用药带来了极其严重的危害。

表416株供体菌与其接合子基因型

Table 4The gene phenotype of 16 strains of donors and transconjugants

供体菌Donorstrain接合子TransconjugantH1oqxA,oqxB,qnrSqnrSH3oqxA,oqxBoqxA,oqxBH5oqxA,oqxB,qnrSqnrSH6oqxA,oqxB,qnrSqnrSH9oqxA,oqxB,qnrSoqxA,oqxB,qnrSH10oqxA,oqxB,qnrSoqxA,oqxB,qnrSH18qnrSqnrSH21oqxA,oqxBoqxA,oqxBH32qnrSqnrSH40qnrSqnrSH47qnrS,qepAqnrSH48qnrSqnrSH53oqxA,oqxB,aac-Ib-croqxA,oqxBH63oqxA,oqxB,qnrSqnrSH69oqxA,oqxB,qnrSqnrSH74oqxA,oqxB,qnrSqnrS

通过药敏试验结果可以发现，87.5%的接合子与供体菌相比发生了耐药谱型的变化，其中68.75%的接合子耐药谱型变窄，说明耐药基因不全都是位于可移动质粒中，或者是不同菌株携带的质粒不同，而质粒之间存在着不兼容性，因此暂时兼容的质粒在失去药物压力的作用下，传递的过程中发生了丢失，因此未能转移到受体菌中[13]；而12.5%的接合子耐药谱型变宽，6.25%的接合子在丢失某种耐药的同时，产生新的药物耐药，而且新增加的耐药表型均为多西环素的耐药性增强，四环素类药物耐药基因的表达和调节主要通过两方面进行：一方面是通过基因自身的调节机制在转录和翻译水平上进行调节，主要包括启动子、操纵基因和茎环结构等；另一方面是通过四环素类药物、pH及Na+和K+等效应物在翻译水平上进行调节，两者相互联系、相互配合，从而使耐药基因得以有效表达和调节[14]。本试验中之所以出现了对多西环素耐药性增强现象，结合前期学者研究成果[15]，分析原因可能是，tet基因在转移的过程中结构发生了变化，因而导致在受体菌中表达增强，或者是在供体菌中存在了抑制四环素耐药基因表达的机制，再或者有可能是不同菌株自身环境的不同造成了tet基因表达水平的差异。

前期学者的报道表明，oqxA和oqxB多共同存在于同一个质粒pOLA52中[16]，oqxA、oqxB和qnrS也可以位于同一个可移动质粒中发生共转移，这与本试验PMQR基因检出结果相一致。并且结合药敏试验结果发现，同转移的PMQR基因越多，对临床氟喹诺酮类药物的MIC值越高。与供体菌MIC相比，接合子MIC值显著降低，分析原因有可能是供体菌中还存在着其他的耐药机制，如染色体喹诺酮决定区突变，也可能是PMQR耐药基因型组合的减少，从而介导了低水平耐药，这也反向证明了多种基因型的组合可以造成高水平耐药，甚至达到临床耐药。

质粒接合试验已经证明PMQR基因能提高喹诺酮药物的MIC值[17]，但许多研究认为这种MIC值提高的程度存在一定限度，只表现为在一定程度上降低细菌对喹诺酮类药物的敏感性，很少能使细菌对喹诺酮类药物达到实际意义的耐药水平，同时有研究指出，质粒接合试验的接合子表现的耐药水平低于供体菌，可能说明染色体介导的耐药机制在细菌耐药中仍然起着主导作用。

4结论

不同的PMQR基因在可移动质粒介导耐药性水平传播的过程中接合成功率存在差异，不同的PMQR基因有可能位于不同的可移动质粒上，通过比较接合前后供体菌和受体菌耐药表型的变化，尤其是PMQR基因检出率的变化，可以初步确定，可移动性质粒在大肠杆菌耐药性水平传播的过程中起到了非常重要的作用，同时质粒接合试验的接合子表现的耐药水平低于供体菌，可能说明染色体介导的耐药机制在细菌耐药中仍然起着主导作用。

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(编辑白永平)

Investigation of Antimicrobial Agents Resistance Transferred Horizontally in Fluoroquinolone ResistantEscherichiacolifrom Swine

WANG Hong-dong，XU Guo-feng，JIAO Wei-wei，ZHANG Xiu-ying*

(CollegeofVeterinaryMedicine，NortheastAgriculturalUniversity，Harbin150030，China)

Abstract:In order to investigate the role of mobile plasmids in the horizontal transmission mechanism of drug resistance inEscherichiacoliisolated from pigs，the conjugation experiments of fluoroquinolone resistance andPMQRgenes positiveEscherichiacoliwere carried out，the minimum inhibitory concentration(MIC) of 8 kinds of common drug in transconjugants were figured by using broth micro dilution method and the plasmid mediated quinolone resistance gene(PMQR) were detected by PCR methods with specific primers designed after the conjugation experiments.The results showed that 16 strains of bacteria were joined successfully within 41 strains of fluoroquinolone resistance andPMQRgenes positive donors，successful rate of conjugation experiments was up to 39%，transconjugants showed kinds of resistant phenotypes compared with J53 strain through testing the figure of MIC values，and compared with donor strains，87.5% of the transconjugants reveals changes of drug resistance patterns and the phenomenon of missing a drug resistance with obtaining another drug resistance，the results of PCR showed the decline of gene phenotypes compared with donor strains，qnrSgene revealed the highest successful conjugation rate，the genes ofoqxAandoqxBcan transferred in the same mobile plasmid，12.5% of the transconjugants displayed that the genes ofoqxA，oqxBandqnrScan be transferred by the same mobile plasmid.The results above suggest that differentPMQRgenes show different success rates in the process of conjugation jointing with mobile plasmid which mediated resistance genes transferred horizontally in strains，which suggest the differentPMQRgenes may be located in the different mobile plasmid，by comparing the changes of drug resistance and gene phenotypes before and after conjugation experiments，especially the detection rate ofPMQRgene，it can be preliminarily confirmed that the mobile plasmids play a very important role in the process that antimicrobial agents resistance genes are transferred horizontally inEscherichiacolistrains.

Key words:Escherichiacoli；plasmid；transconjugants；horizontal transmission

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.021

收稿日期：2015-07-15

基金项目：哈尔滨市科技局科技创新人才基金(2013RFXXJ035)

作者简介：王宏栋(1990-)，男，山东乐陵人，硕士生，主要从事兽医药理学与毒理学研究，E-mail：1026220197@qq.com *通信作者：张秀英，E-mail：zhangxiuying@neau.edu.cn

中图分类号：S852.612

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)04-0805-07