古小彬，朱俊扬，王保健，郑　晶，杨光友，汪　涛，赖为民

(1.四川农业大学动物医学院，成都 611133；2.四川出入境检验检疫局，成都 610041)



四川地区鸡异刺线虫核糖体转录间隔区(ITS1/2)序列的遗传变异分析

古小彬1#*，朱俊扬1#，王保健1，郑晶2，杨光友1，汪涛1，赖为民1

(1.四川农业大学动物医学院，成都 611133；2.四川出入境检验检疫局，成都 610041)

摘要：探讨四川地区鸡异刺线虫(Heterakisgallinarum)的遗传变异情况，为该地区鸡异刺线虫病的流行特征及防控提供基础资料。采用PCR扩增四川7个地区共59个鸡源鸡异刺线虫核糖体ITS1-5.8S-ITS2片段并测序，所得序列剪切5.8S序列后，得到ITS1/2序列，并分析ITS1/2序列的遗传多样性；同时利用GenBank中已公布的异刺属(Heterakis)ITS1/2序列信息，进行系统发育研究。结果如下：59条鸡异刺线虫ITS1/2序列相似性较高(98.9%～100.0%)，ITS1序列间变异较ITS2大；59条序列有20个变异位点和14个单倍型(H1～H14)；四川种群具有丰富的单倍型多样性(Hd=0.532)和较低的核苷酸多样性(π=0.000 94)；种群间基因交流频繁(Nm=31.72)，群体遗传分化不明显(Fst=0.007 82)，以群体内变异为主(AMOVA分析值=99.22%)；从单倍型网络图及进化树(MP和ML)分析来看，7个地理种群未形成显著的地理种群结构，但四川整体种群曾经历过种群扩张(Tajima’sD=-2.553 31，Fu’sFs=-10.564；P<0.05)；进化树(MP和ML)能有效区分鸡异刺线虫与属内其他虫种。四川7个地区鸡的鸡异刺线虫基因交流频繁，遗传多样性较低。

关键词：鸡异刺线虫；四川；ITS1/2 序列；遗传多样性

鸡异刺线虫(Heterakisgallinarum)是大多数家禽及一些野生鸟禽类动物盲肠内最常见的线虫之一[1]，呈世界性分布。我国多个地区均有鸡异刺线虫感染报道，各地感染率为20.30%～76.60%[2-4]。鸡异刺线虫除引起宿主发病和死亡外，还可作为高感染率和高死亡率的火鸡组织滴虫病(又称黑头病，histomoniasis)的重要传播载体[5]。因此，鸡异刺线虫在养殖业和野生鸟禽类保护中具有重要意义。

寄生虫同种物种的不同地理种群，由于地理隔离以及对各自特异的生态环境的长期适应，最终形成了地理种群间的种质差异，从而导致不同虫株的感染力、药物敏感性以及流行病学等特征的差异[6]。而核糖体DNA内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)具有长度适中和较高的进化速率等特点，不仅在种间存在较大的变异性，在同一物种的不同地理种群中也存在着明显的差异性，可用于比较种内群体之间的遗传变异[7]。

目前，ITS序列作为分子标记已经成功地应用于鸡异刺线虫的分子分类鉴定[5]。然而对于不同地理来源鸡异刺线虫的遗传变异情况，有无遗传分化等种群遗传特征仍未见报道。因此，本研究基于核糖体的2个转录间隔区序列(ITS1/2序列)分析了四川7个地区共59个鸡源鸡异刺线虫分离株的遗传多样性及遗传结构等特征，为进一步了解四川地区鸡异刺线虫病的流行特征及防控提供理论依据。

1材料与方法

1.1样品采集

采用循序沉淀法[8]从鸡盲肠内分离收集虫体，经形态学鉴定[9]为鸡异刺线虫，于-20 ℃冰箱保存待用。从四川7个地区共采集到59个鸡异刺线虫样本，样本编号为雅安(YA1～YA9)、西昌(XC1～XC8)、绵阳(MY1～MY9)、达州(DZ1～DZ10)、成都(CD1～CD6)、广元(GY1～GY7)及自贡(ZG1～ZG10)(图1)。

括号里的数字为标注的每个地区所采集的样品数量The numbers of H.gallinarum isolates are shown in each region图1　四川7个地区所采集的59个鸡异刺线虫分布Fig.1　The geographical location of 59 Heterakis gallinarum isolates collected from 7 different geographical regions of the Sichuan province，China

1.2基因组DNA的提取

将冻存的各地鸡异刺线虫1条置于预冷研钵中，加入200 μL 的虫体裂解缓冲液快速研碎虫体，随后加入适量蛋白酶K消化虫体过夜，随后采用酚/氯仿法提取鸡异刺线虫的DNA[10]，提取的DNA于-20 ℃保存备用。

1.3ITS 基因的PCR 扩增及测序

采用保守引物扩增ITS1-5.8S-ITS2序列[7]，引物序列如下，NC5-ITS-R：5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATT-3′；NC2-ITS-F：5′-TTAG-TTTCTTTTCCTCCGCT-3′。扩增体系如下(25 μL)：上、下游引物(20 pmol) 各1 μL，模板DNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，灭菌ddH2O补齐至体系25 μL；且以ddH2O为空白对照；上述试剂混合后瞬时离心。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，49 ℃复性45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。

取PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，将凝胶中条带大小与预期结果相符的胶块切割下来，移入1.5 mL 灭菌离心管中，根据TIANGEN公司的DNA纯化回收试剂盒说明书纯化回收。纯化回收的产物克隆入pMD19-T载体，转化入DH5α感受态细胞，经培养后，以菌液为模板进行PCR鉴定。将PCR阳性菌液送往英潍捷基生物技术有限公司进行正反双向测序。

1.4数据处理与分析

1.4.1序列特征分析根据峰图对测序结果进行人工校对，所有序列经比对和编辑后得到对应的ITS1/2序列。利用Clustal W 1.81分析四川地区鸡异刺线虫ITS1/2序列的变异位点。 MEGA 5.0软件计算各碱基(A、T、C、G)的组成含量。采用DNAStar中的MegAlign程序对所测序列与GenBank数据库中公布的异刺属(Heterakis)ITS1/2序列进行序列同源性比对分析(表1)。

表1异刺属ITS序列信息

Table 1Information of ITS sequences ofHeterakisin GenBank

物种Species地理分布GeographicalDistribution基因Gene序列号GenBankNo.HeterakisgallinarumSichuan四川ITSKT310099～KT310157(本研究Thisstudy)H.gallinarumGuangzhou广州ITSAJ876757H.gallinarumGuangzhou广州ITSAJ876758H.gallinarumAustralia澳大利亚ITS1AJ007453H.gallinarumAustralia澳大利亚ITS2AJ007454H.gallinarumAmerica美国ITSJQ995320H.spumosaSpain西班牙ITSJX845278H.dahomensisSenegal塞内加尔ITSJX845277H.isoloncheChina中国ITSKM212953

1.4.2遗传多样性分析运用DnaSP 5.0软件计算种群的多态位点数、单倍型数(haplotypes)、核苷酸多样性(Nucleotide diversity，π)和单倍型多样性(Haplotypes diversity，Hd)。采用MEGA 5.0软件计算单倍型间的遗传距离(基于Kimura 2-parameter模型)。

1.4.3遗传结构及中性检验分析采用Tcs 1.21软件构建单倍型简约网络图。Arlequin 3.1软件中的分子变异分析(AMOVA)和种群间的遗传差异分析(Fst)了解四川地区的遗传结构；基因流(Nm)由Nm=1/4(1/Fst-1)计算；同时计算种群的中性检验值(Tajima’sD和Fu’sFs)。

1.4.4异刺属系统发育树的构建选用鸡蛔虫(Ascaridiagalli)ITS1/2序列(GenBank No.：AJ007451)作为外群，MEGA 5.0软件中的最大简约法(MP)和最大似然法(ML)构建异刺属的系统发育树，进行重复1 000次的自举检验。

2结果

2.1序列基本特征

成功扩增59个样品的序列，序列长度为1 067或1 068 bp的序列(GenBank No.：KT310099～KT310157)。经比对和编辑后，59个样品的ITS1序列的长度有428或427 bp两种，5.8S序列均为157 bp，ITS2序列均为386 bp。其中59个样品的5.8S序列没有检测到变异位点，其序列相似性为100%。剪切5.8S序列后，将ITS1和ITS2序列串联得到ITS1/2序列，其总长度为814或813 bp。59个鸡异刺线虫分离株的ITS1/2序列共检测出20个变异位点(占2.46%)，包括17个单变异位点和3个简约信息位点。其中14个转换位点，6个颠换位点，7个样品在第19位点存在碱基缺失(表2)。A、T、C、G碱基的平均含量分别为25.6%、32.3%、18.1%、24.0%，A+T碱基含量为57.9%，高于G+C的碱基含量42.1%。

2.2ITS1/2序列相似性分析

研究所得的59条鸡异刺线虫ITS1/2序列间相似性为98.9%～100%，ITS1间与ITS2间序列相似性分别为98.4%～100%和99.0%～100%。本研究中的鸡异刺线虫四川株(59条)与广州株(GenBank No.：AJ876757，AJ876758)、澳大利亚株(GenBank No.：AJ007453，AJ007454)、美国株(GenBank No.：JQ995320)的序列相似性较高(ITS1/2序列：99.3%～99.8%、98.9%～99.5%、96.4%～97.0%；ITS1序列98.8%～99.8%、98.1%～99.1%和92.5%～93.7%；ITS2序列99.2%～99.7%)。

本研究所得的鸡异刺线虫(H.gallinarum)(59条)与H.spumosa(GenBank No.：JX845278)、H.dahomensis(GenBank No.：JX845277)、H.isolonche(GenBank No.：KM212953)序列间相似性较低(ITS1/2序列：61.1%～61.9%、60.8%～61.2%、67.5%～68.1%；ITS1序列：73.1%～74.0%、74.6%～75.5%、78.1%～79.2%；ITS2序列：50.6%～51.0%、46.7%～47.3%、59.1%～59.5%)。

2.3种群遗传多样性分析

四川地区59个鸡异刺线虫分离株的ITS1/2序列共检测出14个单倍型(H1～H14)，单倍型H1被7个地理种群的40个虫株所共享(占67.8%)；雅安株(YA4)、绵阳株(MY4、MY8)、达州株(DZ8)、成都株(CD1)和自贡株(ZG1、ZG6)共享单倍型H2。除成都种群外，其余6个种群都有各自特有的单倍型。四川整体种群的核苷酸多样性(π)为0.000 94，单倍型多样性(Hd)为0.532。四川7个地理种群中，西昌种群的π最高(0.001 84)，而雅安种群的Hd最高(0.722)，成都种群的π和Hd最低(0.000 00和0.333)(表3)。14个单倍型的遗传距离为0.001～0.011，平均遗传距离为0.004。

表3基于ITS1/2序列的四川7地鸡异刺线虫种群遗传多样性指数

Table 3Genetic diversity indexes ofHeterakisgallinarumpopulations from the 7 different geographical regions in Sichuan，calculated from the ITS1/2 sequences

种群Population样品数量No.ofsample单倍型数No.ofhaplotypes单倍型多样性Haplotypediversity(Hd)核苷酸多样性Nucleotidediversity(π)雅安YA9(YA1-YA9)5(H1～H5)0.7220.00123西昌XC8(XC1-XC8)3(H1,H6～H7)0.4640.00184绵阳MY9(MY1-MY9)3(H1,H2,H8)0.5560.00109达州DZ10(DZ1-DZ10)4(H1,H2,H9,H10)0.5330.00049广元GY7(GY1-GY7)3(H1,H11,H12)0.5240.00140成都CD6(CD1-CD6)2(H1,H2)0.3330.00000自贡ZG10(ZG1-ZG10)4(H1,H2,H13,H14)0.6440.00049四川整体种群SC5914(H1～H14)0.5320.00094

YA.Ya’an;XC.Xichang;MY.Mianyang;DZ.Dazhou;GY.Guangyuan;CD.Chengdu;ZG.Zigong;SC.Sichuan.The same as below

2.4种群结构分析

2.4.1单倍型网络图的构建基于14个单倍型构建的单倍型简约网络图结构较为简单(图2)。单倍型H1位于单倍型网络图的中心，为主要单倍型，其余单倍型围绕H1呈辐射状。单倍型间的突变从1步到4步不等。其中H2、H4、H5和H6、H11分别形成2个不同的分支，2个分支均未形成地理聚类。

2.4.2遗传分化和中性检验值AMOVA分子变异分析显示四川种群内的遗传变异是总变异的主要来源(99.22%)，仅有0.78%的变异发生在7个种群间。7个种群间的Fst值为-0.058 82～0.047 82(表4)，均处于较低的分化水平。四川整体种群的总Fst值为0.007 82，总基因流(Nm)为31.72，说明四川种群内的基因交流非常充分，不存在明显的遗传分化。

从中性检验值来看，四川整体种群的Tajima’sD值为-2.553 31(P<0.05)，Fu’sFs值为-10.564(P<0.05)。四川7个地理种群的Taji-ma’sD值为-1.639 82～0.000 00，其中仅西昌种群和绵阳种群差异显著；而Fu’sFs值为-2.979 11～0.971 41，其中雅安种群、达州种群和自贡种群差异显著(表5)。

圆圈的大小与单倍型的分布频率成正比；不同颜色代表来自不同种群的单倍型。YA.雅安；XC.西昌；MY.绵阳；DZ.达州；GY.广元；CD.成都；ZG.自贡The Circle sizes are proportional to the number of isolates.The different colours represent haplotypes from the different populations.YA.Ya’an；XC.Xichang；MY.Mianyang；DZ.Dazhou；GY.Guangyuan；CD.Chengdu；ZG.Zigong图2　鸡异刺线虫14个单倍型构建的单倍型网络图Fig.2　A network map of the 14 haplotypes in Heterakis gallinarum

2.5异刺属系统发育树的构建

基于本研究中得到的鸡异刺线虫(H.gallinarum)14个单倍型ITS1/2序列、GenBank报道的广州株、澳大利亚株、美国株鸡异刺线虫、H.spumosa、H.dahomensis、H.isolonche的ITS1/2序列构建系统发育树(MP和ML)，构树结果见图3。结果显示，MP树和ML树具有非常相似的拓扑结构，不同地理来源的鸡异刺线虫(H.gallinarum)聚为一分支，H.spumosa和H.dahomensis形成一个分支，而H.isolonche单独位于另一个分支。

3讨论

我国是世界养禽大国，养禽业从早期的单一自给、半自给性的农民家庭庭院模式，逐渐演变成规模化的现代集约养殖、庭院养殖及山林养殖等多元化养殖模式。寄生虫是养禽业的常见疾病，种类多，分布广泛，危害严重，而鸡异刺线虫是禽类肠道中最常见的线虫之一，我国各地均有该寄生虫的报道，禽类感染率为20.30%～76.60%[2-4]。据作者调查，四川地区的雅安、西昌、绵阳、达州、成都、广元及自贡7地的鸡异刺线虫感染率为23.3%～57.6%，而这7地属于成都平原或大巴山系、大凉山系等山系，这些山系间有大渡河、青衣江等众多江河，水系发达，从而形成天然屏障，将这7个地区进行隔离；而源自这7地的鸡异刺线虫会不会因山系、河流等地理隔离而出现地理种群间的种质差异呢？带着这个疑问，作者分析了四川地区鸡异刺线虫群体遗传多态性。

表4四川鸡异刺线种群间ITS1/2序列的遗传分化度

Table 4Pairwise fixation index (Fstvalues) ofHeterakisgallinarumpopulations in Sichuan，calculated from nucleotide sequences derived from the ITS1/2 sequences

地区Region雅安YA西昌XC绵阳MY达州DZ广元GY成都CD自贡ZG雅安YA—西昌XC0.02779—绵阳MY0.031250.00384—达州DZ0.047820.016310.00454—广元GY0.00134-0.030210.004310.02378—成都CD0.00552-0.04025-0.05109-0.05882-0.02439—自贡ZG0.047820.016310.004540.00000-0.02439-0.02439—

表5鸡异刺线虫种群ITS1/2序列中性检测指数

Table 5The index of neutrality test ofHeterakisgallinarumITS1/2 sequences

种群PopulationFu’sFsTajima’sD雅安YA-2.97911*-0.93613西昌XC0.97141-1.63982*绵阳MY0.13355-1.60974*达州DZ-2.88102*-1.40085广元GY0.26326-1.43414成都CD0.000000.00000自贡ZG-2.88102*-1.40085四川整体种群SC-10.564*-2.55331*

*.P<0.05

Ascaridia galli 作为外群；AUS.澳大利亚；USA.美国；GZ.广州Ascaridia galli as the outgroup.AUS.Australia；USA.United States of America；GZ.Guangzhou图3　基于异刺属ITS1/2序列构建的系统发育树Fig.3　The phylogenetic trees by Maximum-parsimony (MP and ML) were constructed based on the ITS 1/2 sequences of the genus Heterakis

3.1序列差异分析

鸡异刺线虫种内的ITS1/2序列相似性(96.4%～100%)显著高于种间(与H.spumosa、H.dahomensis、H.isolonche)的序列相似性(60.8%～68.1%)，表明ITS1/2序列在种内更为保守。虽然鸡异刺线虫的ITS1/2序列水平上具有较高的相似性，但不同地理来源虫株的ITS1/2序列也存在一定的差异，其中四川株与美国株的相似性(96.4%～97.0%)明显小于其与广州株和澳大利亚株的相似性(99.3%～99.8%和98.9%～99.5%)。另外，59个鸡异刺线虫样本的ITS1和ITS2的变异也存在明显的差异，变异位点在ITS1和ITS2中分别有13个和7个，碱基缺失仅出现于ITS1上。四川株与广州株、澳大利亚株和美国株的鸡异刺线虫ITS1变异均大于ITS2，进一步支持了吕召宏等[11]的结果。Heterakis属内不同种比较时，却发现ITS2较ITS1表现出更高的变异性，进一步支持了A.Ribas等[1]的结果，他认为H.dahomensis和H.spumosa的ITS2基因(3.12%±0.83%)进化分歧显著高于ITS1(0.97%±0.47%)，表明ITS2在种间变异性更大。因此，作者认为鸡异刺线虫种内的ITS1比ITS2的变异性更大，而ITS2在种间具有更高的变异性。

3.2遗传多样性分析

种群的遗传多样性是种群活力的基础，是物种适应环境变化、维持长期生存和进化的保证，学者们多采用核苷酸多样性(π)和单倍性多样性(Hd)来衡量种群的遗传多样性，这2个指标可反映物种遗传多样性的高低[12]。由于1个碱基的变异就能生成1个新的单倍型，因此Hd可在短时间内积累变异而快速提高，但对π的影响却很小，π值的提高需要长时间的积累，因此π在衡量种群遗传多样性时比Hd更具有代表性[13]。

从本研究来看，四川59个鸡异刺线虫株有14个单倍型(H1～H14)，其中单倍型H1在7个地理种群中均有分布，这种单倍型可认为是能够适应环境变化并在种群中稳定存在的优势单倍型，推测H1是最原始的单倍型[14]。四川7个地区比较发现，除成都种群外，其余6个地区种群都有各自所特有的单倍型，且成都地区Hd也是7个地区最低水平(0.333)，这可能与成都地区属于平原地区，其地势平坦，外环境中鸡异刺线虫的感染性虫卵较容易传播到平原其他地区感染新宿主有关。从单倍型个数和四川整体种群的Hd(0.532)来看，四川地区鸡异刺线虫的单倍型多样性相对较为丰富，而核苷酸多样性的结果却与单倍型多样性相反，其值均较低(小于0.01)，这可能是由于鸡异刺线虫种群历史上出现过瓶颈效应，经历了快速的种群扩张，种群通过变异形成了较高的单倍型多样性，但因扩张时间较短尚未能积累较高的核苷酸多样性水平[15]。而Tajima’sD值和Fu’sFs值(负值且差异显著)又进一步支持了四川地区鸡异刺线虫种群曾经历过种群扩张的推测[16-17]。

3.3遗传结构分析

四川整体种群的遗传分化指数(Fst)(0.007 82)和基因流值(31.27)反映出四川地区鸡异刺线虫种群的基因交流非常频繁，种群间的遗传分化程度较低[18-19]。同时，除成都种群外，各地种群都拥有各自特有的单倍型，表明四川地区不同地理种群间的ITS基因仍存在一定的遗传分化，但是总体来说遗传分化不显著。此外，AMOVA分子变异分析亦表明鸡异刺线虫种群间的遗传变异较小(0.78%)。从单倍型网络图和系统发育树中可见，7个地理种群的单倍型并没有据地理来源形成明显的地理性聚类，表明四川地区的7个鸡异刺线虫种群还未形成显著的地理种群遗传结构。

鸡异刺线虫发育过程中不需要中间宿主，雌虫所产虫卵随宿主粪便排至外环境，在外环境中孵化至含二期幼虫的虫卵后方可感染禽类，由此可见，外环境中的异刺线虫发育阶段本身没有移动扩散能力。本研究中的四川7地被山脉、河流等隔离形成了物种基因交流的天然地理屏障，加之外环境中鸡异刺线虫发育阶段自身移动能力有限，不会引起物种间的高频率基因交流，但从本研究结果来看，这7地鸡异刺线虫的基因交流却非常频繁，究其原因可能有：(1)鸡异刺线虫除寄生于鸡之外，尚可寄生于红腹锦鸡、孔雀、环颈雉等野生鸟禽类，其可随鸟类的飞行被带到其他区域，从而逾越自然的地理屏障。再加上鸡异刺线虫生活史简单，不需要中间宿主，因此被鸟类带到另外一个新的环境中后容易感染宿主。而以往的研究报道亦证实宿主移动影响了寄生虫基因交流，多宿主寄生虫的基因交流水平高于单宿主寄生虫[20-22]。(2)四川各地人民喜食鸡肉，而鸡的养殖规模分布不均，导致四川各地区鸡的贸易频繁，可将鸡异刺线虫随贸易交易从一个地区带到另外一个地区，从而跨越地理屏障。另外，种群间的基因交流可加速或减缓寄生虫对药物的耐药性，这点在毛圆线虫和尖音库蚊(Culexpipiens)中亦得到证实[20，23]。四川地区鸡异刺线虫种群间频繁的基因交流是否会导致这些地区鸡异刺线虫地理种群间耐药基因的传递还有待进一步研究；同时不同地理种群间的火鸡组织滴虫(鸡异刺线虫为传播媒介)的耐药基因是否会随鸡异刺线虫基因交流而传递仍有待解答。

3.4系统发育关系分析

两种拓扑结构非常相似的MP和ML系统发育树表明，异刺属(Heterakis)线虫均可与作为外群的鸡蛔虫(A.galli)予以鉴别。各地的鸡异刺线虫株聚类形成一分支，与同属的H.spumosa、H.dahomensis和H.isolonche能显著区分，其中H.isolonche与鸡异刺线虫较另外2种异刺属线虫的亲缘关系更近，这可能是因为鸡异刺线虫和H.isolonche均寄生于禽类，而H.spumosa和H.dahomensis寄生于啮齿类动物[1，24]有关，进一步推测宿主因素对ITS1/2序列也存在一定的影响。

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(编辑白永平)

Genetic Variation of Heterakis gallinarum in Sichuan based on the Nuclear Ribosomal DNA Internal Transcribed Spacer Regions (ITS1/2)

GU Xiao-bin1#*，ZHU Jun-yang1#，WANG Bao-jian1，ZHENG Jing2，YANG Guang-you1，WANG Tao1，LAI Wei-min1

(1.CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611133，China；2.SichuanEntry-exitInspectionandQuarantineBureau，Chengdu610041，China)

Abstract:The aim of the present study was to analyze the characteristic of genetic variability inHeterakisgallinarumpopulations from Sichuan province，and provide a foundation for understanding the epidemiology and assist in the control of heterakiasis.The nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer region (ITS1-5.8S-ITS2) of 59H.gallinarumisolates from chickens belonged to 7 different geographical regions were amplified using the polymerase chain reaction (PCR) and then sequenced.Sequences unit containing ITS1 and ITS2 (excepting 5.8S) were used to determine the genetic variability and genetic structure ofH.gallinarumin Sichuan province，China.Meanwhile，the relationships of this nematode with selected members of genusHeterakiswere assessed by phylogenetic analysis of ITS1/2 sequence datasets by maximum parsimony (MP) and maximum likelihood (ML).Results showed that 59H.gallinarumITS1/2 sequences identity ranged from 98.9% to 100.0%，and ITS1 sequences displayed greater variability than ITS2.Fifty-nine sequences contained 20 variable sites，and were classified into 14 haplotypes (H1-H14).The overall Sichuan population showed high haplotype diversity (Hd= 0.532) and low nucleotide diversity (π=0.000 94).Meanwhile，a frequency of gene flow (Nm=31.72)，a low degree of genetic differentiation (Fst=0.007 82)，and an overwhelming genetic variability (99.22%) were observed within the overall Sichuan population.Phylogenetic trees (MP and ML) and haplotype network were both revealed that 7 different geographical regions did not form significant geographical populations.The different species within genusHeterakiswere well distinguished in phylogenetic trees (MP and ML).Our results indicate that there is a high gene flow and low degree of genetic diversity acrossH.gallinarumpopulation.

Key words:Heterakisgallinarum；Sichuan；ITS1/2 sequences；genetic variation

doi:10.11843/j.issn.0366-6964.2016.04.020

收稿日期：2015-10-20

基金项目：四川农业大学学科“双支计划”(SC-03571357)

作者简介：古小彬(1982-)，女，四川自贡人，副教授，主要从事动物寄生虫与寄生虫病学研究；朱俊扬(1990-)，男，四川成都人，硕士，主要从事动物寄生虫与寄生虫病学研究。#对本研究具有同等贡献，并列第一作者 *通信作者：古小彬，副教授，硕导， E-mail: guxb121@126.com

中图分类号：S852.731

文献标志码：A

文章编号:0366-6964(2016)04-0796-09