陈慧永，孙　超，沈捷雯，索林格

(上海黄浦区中西医结合医院，上海 200010)

白芍总苷对大鼠急性胰腺炎炎性反应及PKD1、NF-κB蛋白表达的影响研究

陈慧永，孙超，沈捷雯，索林格

(上海黄浦区中西医结合医院，上海 200010)

[摘要]目的探讨白芍总苷对大鼠急性胰腺炎炎性反应及PKD1、NF-κB蛋白表达的影响。方法将72只SD大鼠随机分为空白组、模型组、白芍总苷20 mg/kg组、白芍总苷40 mg/kg组、白芍总苷60 mg/kg组、甲磺酸加贝酯10 mg/kg组，每组12只。除空白组外，其余组大鼠均采用逆行胰胆管注入 3.5%牛磺胆酸钠并保留1 min的方法建立急性胰腺炎大鼠模型。空白组、模型组均给予生理盐水尾静脉注射，各给药组给予相应剂量的药物尾静脉注射。干预12 h后取血检测血清淀粉酶(AMY)、TNF-α、IL-6、IL-8水平；干预24 h后处死大鼠记录大鼠胰腺湿质量、腹水量，镜下观察胰腺组织病理改变，采用 Western-blot 方法检测胰腺组织中 PKD1、 NF-κB 表达水平。结果模型组血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8水平及胰腺湿质量、腹水量均显著高于空白组(P均<0.05)，各给药组血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8水平，胰腺湿质量与腹水量均显著低于模型组(P均<0.05)，且白芍总苷各剂量组各指标水平呈剂量依赖性降低(P均<0.05)。模型组PKD1、NF-κB蛋白表达水平均明显高于空白组(P均<0.05)，各给药组PKD1、NF-κB蛋白表达水平均明显低于模型组(P均<0.05)，白芍总苷60 mg/kg组PKD1、NF-κB蛋白表达水平均明显低于其他给药组(P均<0.05)。结论白芍总苷可显著抑制急性胰腺炎大鼠炎症反应，可能与其降低PKD1、NF-κB蛋白表达有关。

[关键词]急性胰腺炎；白芍总苷；炎症因子；蛋白激酶

急性胰腺炎(AP)是临床上发病率较高、危害患者生命的急腹症之一。该病主要表现为局部或全身性炎症反应及胰腺组织的改变，预后不良，病死率10%～20%[1]。目前急性胰腺炎的发病机制尚不明确，但认为与炎症反应、胰腺泡内钙超载、自噬凋亡等密切相关[2]。白芍总苷(TGP)是从中药白芍药根中提取的有效成分，主要含芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯苷及苯甲酰芍药苷等，具有调节细胞因子如肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)等作用，因此具有广泛的抗炎作用[3]。我院前期验证性采用白芍总苷治疗急性胰腺炎患者取得了良好的临床疗效，但其作用机制尚不明确。故本研究观察了白芍总苷对大鼠急性胰腺炎炎性反应及PKD1、NF-κB蛋白表达的影响，旨在探讨该药的作用机制。

1实验资料

1.1实验动物健康雄性SD大鼠，体质量 200～250 g，SPF 级，由上海第二军医大学动物实验室提供，许可证号：SCXK (军)2014-0144。实验室室温(23±2)℃，相对湿度 40%～70%。适应性饲养1周，喂以常规实验室饲料。实验前12 h 起禁食，不控制饮水。

1.2药物和试剂苯巴比妥(上海第二军医大学实验室配制)；牛磺胆酸钠(美国Sigma 公司)；0.9%氯化钠注射液(四川科伦药业有限公司)；10%中性缓冲福尔马林固定液(上海天威医药化工有限公司)；IL-6、TNF-α放射免疫试剂盒(南京建成有限公司)。鼠抗人PKD多克隆抗体，鼠抗人β-actin单克隆抗体，鼠抗人p65NF-κB抗体，羊抗鼠p65NF-κB二抗，羊抗鼠PKD二抗(美国ABZOOM公司)。苏木素-伊红溶液(第二军医大学实验室配制)，注射用甲磺酸加贝酯(常州四药制药有限公司)，白芍总苷(华润三九医药有限公司，批号：20152247，纯度93.7%)。

1.3实验方法将72只SD大鼠随机分为空白组、模型组、白芍总苷20 mg/kg组、白芍总苷40 mg/kg组、白芍总苷60 mg/kg组、甲磺酸加贝酯10 mg/kg组，每组12只。除空白组外，其余组大鼠均参照文献[4]方法造模：腹腔注射苯巴比妥后剑突下正中2 cm切口开腹，充分暴露十二指肠及其系膜内的胆胰管，夹闭胆胰管，一次性静脉留置套管针，套管针插入胆胰管约1.0 cm，立即将浓度3.5%的牛磺胆酸钠以0.1 mL/min的速度注射入胰胆管，给药量为 1.0 mL/kg，然后闭合胰胆管近乳头处，在无菌环境中缝合腹腔。造模后空白组、模型组均给予生理盐水尾静脉注射，各给药组给予相应剂量的药物尾静脉注射。干预12 h后取各组大鼠静脉血1 mL测定血清淀粉酶(AMY)及TNF-α、IL-6、 IL-8水平。干预24 h后处死大鼠，记录腹水量，分离胰腺组织并称质量，然后固定于 10%福尔马林液中，石蜡包埋，5 μm 连续切片，取胰头部位组织行HE染色，光镜下观察胰腺的病理组织学改变，同时采用Western-blot法检测胰腺组织中PKD1、NF-κB表达情况。

2结果

2.1各组动物死亡情况空白组无大鼠死亡；造模12 h后模型组死亡3只, 白芍总苷20 mg/kg组死亡2只，其余组均未发生死亡。

2.2各组大鼠血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8 水平模型组血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8水平均显著高于空白组(P均<0.05)，提示造模成功。各给药组血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8水平均显著低于模型组(P均<0.05)，且白芍总苷各剂量组各指标水平呈剂量依赖性降低(P均<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠血清AMY、TNF-α、IL-6、 IL-8 水平比较

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与白芍总苷20 mg/kg组比较，P<0.05；④与白芍总苷40 mg/kg组比较，P<0.05。

2.3各组大鼠胰腺湿质量及腹水量模型组胰腺湿质量与腹水量均显著高于空白组(P均<0.05)，提示造模成功。各给药组胰腺湿质量与腹水量均显著低于模型组(P均<0.05)，且白芍总苷各剂量组胰腺湿质量与腹水量呈剂量依赖性降低(P均<0.05)。见表2。

2.4各组大鼠胰腺组织病理学表现空白组胰岛形态、数目正常，胰腺细胞形态轮廓正常，细胞膜、胞浆、核均较为清晰，未见炎症细胞浸润，见图1。模型组可见大部分胰腺细胞破裂，正常胰腺数目极少，大量腺泡坏死崩解，结构紊乱，核固缩、坏死，大量中性粒细胞浸润，见图2。甲磺酸加贝酯10 mg/kg组胰腺细胞形态、数目不正常，胰泡细胞部分排列较为紊乱，炎症细胞浸润，但浸润程度低于模型组，部分胰腺细胞核固缩、坏死，见图3。白芍总苷20 mg/kg组胰腺细胞炎症浸润、坏死程度、数量形态等与模型组相似，见图4。白芍总苷40 mg/kg组胰腺细胞坏死程度较20 mg/kg组明显减轻，炎症浸润、细胞形态与甲磺酸加贝酯10 mg/kg组相似，见图5。白芍总苷60 mg/kg组炎症浸润、细胞坏死程度明显轻于40 mg/kg组及甲磺酸加贝酯10mg/kg组，细胞形态部分正常。见图6。

表2　各组大鼠胰腺湿质量及腹水量比较±s)

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与白芍总苷20 mg/kg组比较，P<0.05；④与白芍总苷40 mg/kg组比较，P<0.05。

图1　空白组大鼠胰腺组织病理表现

图2　模型组大鼠胰腺组织病理表现

图3　甲磺酸加贝酯10 mg/kg组大鼠胰腺组织病理表现

图4　白芍总苷20 mg/kg组大鼠胰腺组织病理表现

图5　白芍总苷40 mg/kg组大鼠胰腺组织病理表现

图6　白芍总苷60 mg/kg组大鼠胰腺组织病理表现

2.5各组大鼠胰腺组织中PKD1、NF-κB表达情况模型组PKD1、NF-κB蛋白表达水平均明显高于空白组(P均<0.05)。各给药组PKD1、NF-κB蛋白表达水平均明显低于模型组(P均<0.05)，白芍总苷60 mg/kg组PKD1、NF-κB蛋白表达水平均明显低于其他给药组(P<0.05)。见表3。

3讨论

急性胰腺炎是由多种因素引起胰酶激活导致胰腺炎症反应，伴或不伴有其他器官功能改变的疾病[4]。急性胰腺炎发生、发展过程中产生一系列炎症递质，导致炎症的“瀑布样级联反应”，使病情进行性加剧，如不及时治疗，最终引发SIRS和MODS而导致死亡[4-6]。IL-6、IL-8、TNF-α被证实在胰腺炎发作后迅速增加，是导致胰腺炎患者死亡的高危因素[7]。介导胰腺炎症反应的重要信号分子包括PKD1和NF-κB，TNF-α、IL-1β、IL-2、COX2、趋化因子、黏附分子、集落刺激因子等多种参与早期炎症反应和免疫反应的因子都受二者调控[8-14]。PKD是一种具有3个亚型的新的丝氨酸/苏氨酸蛋白质，分别为PKD1、PKD2、PKD3，尤其是PKD1/PKD2 在机体天然免疫应答过程中起着重要作用，其中PKD1可作为NF-κB的下游蛋白，参与炎症反应的发生[13-14]。NF-κB信号通路亦被多项研究证实在胰腺炎炎症反应中扮演重要的角色，是细胞信号传递的重要因子，是免疫、炎症、应激、机体防疫、组织损伤、凋亡等多种反应的参与因子[13]。在感染、损伤刺激下，上游信号将诱使NF-κB 活化，而活化的NF-κB 将启动多种基因的转录，如炎症因子，这将加速炎症因子的表达，而炎症因子又可进一步刺激NF-κB 活化，两者形成爆发式的连锁反应，最终诱使局部组织炎症反应，导致组织坏死[15-16]。

表3　各组大鼠胰腺组织中PKD1、NF-κB表达情况

注：①与空白组比较，P<0.05；②与模型组比较，P<0.05；③与白芍总苷60 mg/kg组比较，P<0.05；④与甲磺酸加贝酯10 mg/kg组比较，P<0.05。

白芍总苷是白芍的主要有效成分，其具有多途径抑制炎症反应、拮抗氧化应激反应等作用，主要用于类风湿关节炎、干燥综合征和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗[17-19]，其用于急性胰腺炎的治疗报道较少。本研究结果显示，在造模后12 h，血清促炎性细胞因子IL-8、IL-6、TNF-α水平均明显升高；给予白芍总苷干预后，各指标水平均明显低于模型组，并呈现剂量依赖性。说明白芍总苷可显著抑制急性胰腺炎所致的炎症反应。胰腺一般状态及病理研究显示，白芍总苷60 mg/kg组胰腺湿质量与腹水量均明显低于模型组，胰腺细胞炎症浸润程度和细胞坏死程度轻，进一步说明白芍总苷可抑制胰腺组织内炎症反应的进展。Western-blot结果显示模型组PKD1、NF-κB蛋白表达过高，白芍总苷干预后PKD1、NF-κB蛋白表达水平明显降低，提示白芍总苷可抑制急性胰腺炎大鼠炎症反应，减轻胰腺组织损伤。

综上所述，白芍总苷可显著抑制胰腺炎炎症反应，减轻炎症所致的胰腺损伤，可能与其降低PKD1、 NF-κB蛋白表达有关。

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Study on effects of total peony glucosides on inflammatory reaction and expression of PKD1 and NF-κB in acute pancreatitis rats

CHEN Huiyong， SUN Chao, SHEN Jiewen, SUO Linge

(Huangpu Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Shanghai 200010, China)

Abstract:Objective It is to explore the effects of total peony glucosides (TPG) on inflammatory reaction and expression of PKD1 and NF-κB in acute pancreatitis (AP)rats. Methods 72 SD rats were randomly divided into blank group, model group, 20 mg/kg TPG group, 40 mg/kg TPG group,60 mg/kg TPG group,10 mg/kg gabexate mesylate group, each group had 12 rats. All the rats except in blank group were used to establish AP models by retrograde cholangiopancreatography injection of 3.5% sodium taurocholate and retention method 1 min. Blank group and model group were given normal saline by tail vein injection, and the other 4 groups were given respective drugs bye the same method. The levels of blood NF-α, IL-6, IL-8 were determined after intervention for 12 h, after 24 h, the rats were killed to measure pancreas wet weight，ascites were recorded and pathological changes of pancreas tissue were observed, PKD1, NF-κB expression were detected by Western-blot method besides. Results The levels of serum AMY, NF-α, IL-6, IL-8 and pancreas wet weight，ascites in model group were all higher than that in blank group (P all<0.05), and these indexes in every treatment group were lower than that in model group (P all<0.05), the decreasing showed a dose dependence in every TPG groups (P<0.05). The expression level of PKD1 and NF-κB in model group were higher than that in blank group (P<0.05), but the expression levels were lower in every treatment group than that in model group (P<0.05), the levels in 40 mg/kg TPG group and 60 mg/kg TPG group were lower than that in the other treatment groups (P<0.05). Conclusion TGP can alleviate the inflammatory response and pancreatic necrosis. The mechanism may be related with the inhibition of expression of PKD1 and NF-κB.

Key words：acute pancreatitis； total peony glucosides;inflammatory cytokines; protein kinase

[作者简介]陈慧永,男,副主任医师，主要从事普外科临床诊治工作。

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.10.002

[中图分类号]R-332

[文献标识码]A

[文章编号]1008-8849(2016)10-1030-04

[收稿日期]2015-10-17