杨容孑，刘柿良，宋会兴，杨亚男，潘远智

四川农业大学风景园林学院，四川 成都 611130



不同氮形态对龙葵镉积累、抗氧化系统和氮同化的影响

杨容孑，刘柿良，宋会兴，杨亚男，潘远智*

四川农业大学风景园林学院，四川 成都 611130

摘要：以镉超积累植物龙葵（Solanum nigrum L.）为材料研究了不同氮形态对其镉（Cd）积累的影响及其生理响应机制，为今后利用龙葵进行植物冶金和镉污染土壤修复提供理论依据。采用龙葵室内盆栽控制试验，采用不同浓度3种氮形态［铵态氮（NH4）2SO4、硝态氮NaNO3、硝态-铵态氮NH4NO3］处理，以植株生长为重要参考，研究其对镉积累、抗氧化系统和氮同化的影响。结果表明，（1）镉（10～160 mg·kg-1）显著影响龙葵生长，降低生物量积累；外施3种形态氮均能缓解40 mg·kg-1镉毒害，提高地上部生物量、叶绿素含量和镉累积量，且铵态氮对生物量增产与镉累积效果优于其他形态氮肥，其中400 mg·kg-1的NH4SO4最为明显。（2）植株叶片过氧化氢（H2O2）水平随施铵态氮和铵态-硝态氮量增加而降低，随施硝态氮量增加而先降后升。（3）过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）随施硝态氮与硝态-铵态氮浓度增加而减低，超氧化物歧化酶（SOD）活性随施硝态氮量增加先升后降；POD活性随施加铵态氮浓度增加而逐渐升高，显示铵态氮能显著提升幼苗抗氧化能力。（4）随硝态氮施加量增加，硝酸还原酶（NR）和谷氨酰胺合成酶（GS）活性先升后降；而GS活性在铵态氮施加量为100 mg·kg-1时达到最大，随后逐渐降低。同时，谷氨酸脱氢酶（GDH）活性随着3种不同形态氮施加量的增加逐渐降低。从植物修复角度出发，铵态氮对龙葵的强化修复效果优于硝态氮与硝态-铵态氮，尤其是400 mg·kg-1的NH4+为龙葵镉修复的最佳浓度。

关键词：龙葵；氮形态；镉胁迫；氮同化；抗氧化系统

引用格式：杨容孑，刘柿良，宋会兴，杨亚男，潘远智.不同氮形态对龙葵镉积累、抗氧化系统和氮同化的影响［J］.生态环境学报，2016，25（4）:715-723.

YANG Rongjie，LIU Shiliang，SONG Huixing，YANG Yanan，PAN Yuanzhi.Impacts of Different Nitrogen Forms on Cadmium Accumulation，Antioxidant System and Nitrogen Assimilation in Hyperaccumulator Solanum Nigrum L.［J］.Ecology and Environmental Sciences，2016，25（4）:715-723.

近年来，土壤重金属污染已成为危害人类健康的重大因素（刘柿良等，2013；张永平等，2014；Liu et al.，2016）。植物修复技术，尤其利用超积累植物（Hyperaccumulators）对土壤重金属进行植物提取，已被认为是成本最低且对环境无二次污染的友好型治理技术（Wang et al.，2008）。然而，目前发现的大多数超积累植物生长缓慢，生物量较小（刘柿良等，2014；Liu et al.，2015；李虹颖等，2016），修复效率低且不适宜大面积使用，从而限制了该技术的应用和推广。同时，植物吸取修复效率与土壤污染物浓度及其有效性相关，即污染物浓度越高，修复效率越低（胡鹏杰等，2014）。研究表明，通过增施肥料、土壤改良等农艺措施可提高修复植物生长速度、生物量及重金属积累量（Xu et al.，2010；Li et al.，2014），是提高植物修复效率最有效手段之一。

土壤-植物系统中，氮（N）素是植物必需“生命元素”和生长限制元素（Vitousek et al.，2010；张敏等，2013；陈久耿等，2014）。氮肥作为最常用的化肥，在提高作物产量、改善品质和培肥地力等方面作用显著（Maier et al.，2002；张敏等，2013；张永平等，2014）；且能影响植物生物分配格局，以及土壤重金属生物有效性和植物对重金属的吸收能力（胡鹏杰等，2014；刘柿良等，2015）。因此，通过合理施用氮肥，提高重金属污染土壤的修复效率，是目前植物修复的重要强化措施之一。研究表明，随氮肥用量的增加，土壤镉的生物有效性提高，但不同形态氮肥对其影响差异显著（Maier etal.，2002）。例如，施用铵态氮肥（NH4+-N）降低铅（Pb）对鱼腥草（Houttuynia cordata）的毒害，促进玉米（Zea mays）对重金属的吸收；硝态氮肥（NO3--N）则利于Pb2+由鱼腥草根部向上转移（楼玉兰等，2005；杨刚等，2007），其原因是由于不同形态氮对植物生长的表型影响不尽相同（杨刚等，2007）。目前，有关氮肥对超积累植物重金属积累及氮同化的影响极少报道，其对植物的调节机理也尚未明了。

龙葵（Solanum nigrum L.）是我国新近发现的镉超积累植物（Wei et al.，2004），不仅生物量大，对土壤镉具超积累特性，且具有多年生、无性繁殖、适于刈割的特点，是实施植物修复和研究植物超积累机制的优良材料。然而，目前对优化龙葵修复效率的农艺措施研究不多，施用不同形态氮对镉积累的促进作用及其机理也尚未报道。因此，本文通过盆栽控制试验，比较研究不同形态氮肥对龙葵幼苗镉积累、抗氧化系统和氮同化的影响，以期为龙葵进一步开发和利用提供科学依据，对推动重金属污染土壤的植物修复技术的应用推广具有重要意义。

1　材料与方法

1.1供试材料

供试龙葵种子由北京医科院药用植物研究所提供。试供土壤采于四川农业大学成都校区实验基地（103º51'E，30º42'N）周边自然土壤［黄壤（紫色土），即园土］，不含腐叶根，采样深度为表层0～20 cm；发酵土由成都温江区花木交易中心提供。氮肥为：铵态氮［（NH4）2SO4］、硝态氮（NaNO3）、硝态-铵态氮（NH4NO3），不含结晶水；试验试剂为氯化镉（CdCl2·2.5H2O），均为分析纯。

1.2试验方法

2014年6月中旬，将采集的园土自然风干、捣碎、剔除杂物，研磨，过5 mm筛。按1∶1（W/W）将发酵土和园土均匀混合成试验种植土，在干燥的实验室堆积静置45 d。然后将种植土（干土）按照每盆5.00 kg标准统一装入带托盘塑料花盆。将装有种植土的塑料花盆置于实验大棚，用不含镉等干扰物质的柱层析去离子水控制土壤含水量为田间持水量的60%。种植土（园土+发酵土）的基本理化性质为：pH值6.8，全氮（N）0.73 g·kg-1，全磷（P）0.38 g·kg-1，全钾（K）3.76 g·kg-1，有机碳（C）32.92 g·kg-1，总Cd为0.419 mg·kg-1。

2014年8月15日，将龙葵种子消毒后播种于穴盘。待幼苗长出4片真叶时，挑选健壮且长势一致的植株移栽至塑料花盆，每盆3株，种植深度1.5～2.0 cm。植物恢复生长后，于2013年9月29日开始镉处理。根据国家土壤环境质量标准和四川盆地重金属污染发展概况，以不添加镉作为对照，镉处理水平为：10、20、40、80和160 mg·kg-1（不含背景值，以Cd2+计），每处理3次重复。按预先设置水平于每盆中添加Cd2+，添加方法为以分析纯CdCl2·2.5H2O与去离子水配制成500 mL溶液均匀施入塑料盆（渗出液反复回收浇灌）。2014年10月1日收获不同处理下的龙葵植株，测定植株根长、株高及各器官干重，获得最佳镉胁迫浓度以进一步试验。

2014年10月5日，按照上述方法处理种植土和试供植物。待植物恢复生长后，以固体形式施加氮肥和镉（最佳浓度）。试验中，3种形态氮素的处理水平分别设定为：0［CK］、25［N25］、50［N50］、100［N100］、200［N200］、400［N400］ mg·kg-1（干土）。为保证最终施入土壤的氮量相同，施加硝态氮（NO3+-N，NaNO3）量分别为：795、1590、3180、6360和12720 mg；铵态氮［NH4+-N，（NH4）2SO4］量为：590、1180、2360、4720和9440 mg；硝态-铵态氮［NO3+/NH4+-N，NH4NO3］为：357、714、1428、2856和5712 mg。2014年11月7日收获不同处理龙葵植株，蒸馏水数次洗净（根系在20 mmol·L-1Na2-EDTA溶液中浸泡15 min），待测。测定均重复3次。

试验中，精心养护管理，视植物的生长情况浇水，浇水时将溢出的水倒回盆内。同时，若盆内有杂草应及时拔掉放回盆中，减少水分与养分的流失。为避免其他物质影响结果，试验中不喷施农药，不追施化肥。该试验大棚中透光率为80%，温度（26±3）℃，室内外温度接近，平均相对湿度约为70%。

1.3测定方法

选取不同处理下幼苗，采用游标卡尺测量根长（主根长）、基径和株高。同时，参照李合生等（2000）方法测定叶片叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）含量，计算总叶绿素（Chl）及叶绿素a/b（Chla/b）。同时，样品分为地上部（叶、茎和果）和地下部（根系）。105 ℃烘箱内杀青30 min，再在75 ℃下烘干至恒重，计算单株生物量。

植物组织中Cd测定。称取0.1 g样品在电炉上炭化，后在550 ℃马福炉中干灰化6 h，5 mL 6 mol·L-1HCL溶解，过滤，0.1 mol·L-1HCL定容至50 mL，使用火焰原子吸收光谱仪（SHIMADZU AA-6300，Kyoto，Japan）测定Cd（李虹颖等，2016）。

取0.2 g新鲜叶片置于预冷研钵中，加入5 mL预冷50 mmol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.8）研磨，然后用磷酸缓冲液（PBS）定容至10 mL在4 ℃下离心15 min（10000×g），取上清液并测定过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）含量。MDA含量测定采用Cakmak et al.（1992）方法测定；H2O2含量测定参照Patterson et al.（1984）方法。同时，参照李合生等（2000）方法采用紫外吸收法测定CAT活性，3 mL反应体系中含有50 mmol·L-1PBS和10 µL 30% H2O2，加入0.1 mL酶液启动反应（不加H2O2为对照），反应5 min后测∆240降低速率，每分钟∆240降低0.01定义为1个酶活力单位［U/（g·min-1）］。同时，采用愈创木酚法测定POD活性（1），采用氮蓝四唑光化还原法测定SOD活性（2），其计算公式分别为：

其中，∆470为反应时间内吸光值变化；WF（g）为材料鲜重；T（min）为反应时间；VT（mL）为提取酶总体积（mL）；VS（mL）为取用酶液体积。

其中，A1为照光对照管吸光度；A2为样品管吸光度；V（mL）为样品液总体积；Vt（mL）为测定样品用量；W（g）为鲜重。

参照Nagalakshmi et al.（2001）方法，采用巯基试剂2-硝基苯甲酸（DTNB）测定还原型谷胱甘肽（GSH）含量。取1.0 g样品，加入3 mL 3%的三氯乙酸（TCA）研磨匀浆离心（10000×g，20 min），取上清液1 mL于试管中，加入2 mL 150 mmol·L-1NaH2PO4溶液（pH 7.7），混合后加入DTNB试剂（39.6 mg DTNB溶解于10 mL 0.15 mol·L-1PBS，PBS溶液 pH=7.0），5 min后测定∆412吸光度。

参照Wallace et al.（1965）的方法测定硝酸还原酶（NR）活性。取鲜样0.5 g，向对照试管中加入1.0 mL 30% TCA溶液，再向各试管加入9.0 mL 0.1 mol·L-1KNO3溶液，抽气1 h，25 ℃暗反应30 min后加入1.0 mL 30% TCA、2.0 mL 1%磺胺溶液和2.0 mL 0.02%萘胺溶液显色20 min，540 nm下比色。同时，称取0.5 g预冷鲜样，加入4.0 mL 0.05 mol·L-1pH 7.4的磷酸缓冲液（含0.4 mol·L-1蔗糖、4 mmol·L-1L-半胱氨酸）于研钵，10000×g离心10 min，上清液用于酶活性测定。采用Kaiser et al.（1984）方法测定谷氨酰胺合成酶（GS）活性；谷氨酸脱氢酶（GDH）活性测定采用Singh et al.（1986）方法。

1.4数据分析

数据采用SPSS 17.0软件统计分析，单因素方差检验（One-way ANOVA）和最小显著性差异法（LSD）检验，Microsoft Excel 2013制表作图。显著性水平设定为α=0.05。数据表达方式为：平均数±标准差。

2　结果与分析

2.1镉对龙葵幼苗生长及生物量的影响

株高和基径粗是植物生长的重要指标。表1显示，根长与基径均随镉胁迫浓度的增大而先升高后降低，在10、20或40 mg·kg-1镉处理时达到最大；而株高则在20 mg·kg-1镉处理时达最大值，160 mg·kg-1镉处理时较对照（0 mg·kg-1镉处理）差异不显著（P＞0.05）。随着镉胁迫程度增强，龙葵幼苗单株和根系干重在0～40 mg·kg-1处理间差异不显著，茎、叶和果实干重的变化趋势不一。与对照相比，果实干重则在20和40 mg·kg-1镉处理下无明显变化，高浓度镉（80和160 mg·kg-1）胁迫显著降低其生物量。因此，本研究选择4 0 mg·kg-1镉浓度进一步试验。

2.2不同形态氮对镉胁迫下龙葵生物量的影响

40 mg·kg-1镉处理下，施加硝态氮的龙葵地上部干重在200 mg·kg-1处理时显著增加，施氮量为200和400 mg·kg-1时较对照（CK）处理提高60.81% 和61.15%；而地下部干重却无明显变化（P＞0.05）。相似地，龙葵地上部干重随施铵态氮量增加逐渐增加，施加25和50 mg·kg-1时则与CK处理无显著差异；而施加不同浓度铵态氮对地下部干重无显著影响。同时，随施加硝态-铵态氮量增加，地上部干重逐渐增加，而地下部干重在施氮量为50 mg·kg-1时发生转折。当施400 mg·kg-1铵态氮时，地上部干重较CK提高88.76%，增量显著高于施用400 mg·kg-1硝态氮（61.15%）与硝态-铵态氮（76.75%）较CK处理的增量（表2）。

表1　镉处理下龙葵幼苗生长指标及器官干重的变化Table 1 Growth index and dry weight of different parts of S.nigrumplants under Cd treatments

表2　不同形态氮对镉处理下龙葵幼苗干重的影响Table 2 Effect of different nitrogen forms on dry weight of S.nigrum plants under Cd treatments

2.3不同形态氮对镉胁迫下龙葵Cd积累的影响

施加不同浓度硝态氮，龙葵地上部镉累积量（μg·g-1）随施加浓度升高而显著增加，当施加量为400 mg·kg-1时较CK处理提高23.15%；地下部镉累积量在50和100 mg·kg-1施氮量时升高到最大，随之逐渐降低。与之不同地，地下部镉累积量在100 mg·kg-1施加硝态-铵态氮时达到最高，随后与之持平。而施加铵态氮时，地上部和根系镉累积量随施加浓度升高而增大，400 mg·kg-1施氮量时镉累积最高，且较CK处理分别提升56.48%和94.24%（表3）。同时，铵态氮对龙葵地上部和根系镉的累积能力在施氮量为400 mg·kg-1时显著高于铵态氮和硝态-铵态氮。另一方面，施加氮肥显著影响龙葵单株对土壤镉的累积（μg·plant-1）。随着不同形态氮施加量增加，单株镉累积量均表现为不同程度地增加。其中，施加200和400 mg·kg-1铵态氮时单株镉累积量达最大，较CK处理提升149.84%和152.90%，且在此处理下单株累积量显著高于硝态氮和硝态-铵态氮处理组（表4）。

2.4不同形态氮对镉胁迫下龙葵叶绿素的影响

施3种形态氮肥时，Chla、Chlb、Chl含量均随施加浓度增加而呈不同程度增加，在浓度为400 mg·kg-1时达到最大值（表5）。施加400 mg·kg-1铵态氮时，Chl含量较CK显著提升86.97%，显著高于施加铵态氮（75.91%）和硝态-铵态氮（59.41%）引起的增加量；且在400 mg·kg-1施氮量时，Chla、Chlb、Chl含量在施加铵态氮时显著高于铵态氮和铵态-硝态氮处理。同时，施加硝态-铵态氮下的Chla/b随施加浓度增加逐渐降低，而施加其他两种形态氮肥时无明显变化（P＞0.05）。

2.5不同形态氮对镉胁迫下抗氧化系统的影响

表3　不同形态氮对镉处理下龙葵植株组织镉累积的影响Table 3 Effect of different nitrogen forms on Cd accumulation in shoot and root of S.nigrum plants under Cd treatments

表4　不同形态氮对镉处理下龙葵单株镉累积的影响Table 4 Effect of different nitrogen forms on Cd accumulation in the whole plants under Cd treatments

龙葵叶片活性氧（H2O2）水平随施铵态氮和铵态-硝态氮量的增加而降低，随施硝态氮量增加而先降（100和200 mg·kg-1）后升（图1A）。相似地，MDA含量在施硝态-铵态氮量为50 mg·kg-1时最低，后升高到稳定值（100～400 mg·kg-1）；MDA含量随其他两种形态氮施加量增加而逐渐降低（图1B）。

表5　不同形态氮对镉胁迫下龙葵叶绿素含量的影响Table 5 Effect of different nitrogen forms on chlorophyll content of S.nigrum under Cd treatments

图1　不同形态氮对镉胁迫下龙葵叶片抗氧化系统的影响Fig.1 Effect of different nitrogen forms on antioxidative system of S.nigrum under different Cd treatments

施加硝态氮时，CAT和POD随着施加浓度增加而减低，SOD活性则先升后降，施加量为25或50 mg·kg-1时达到最高值，200和400 mg·kg-1时无显著差异（图1C～E）。随施加铵态氮浓度增加，SOD活性逐渐降低，POD则逐渐升高；CAT则在施加量为25和50 mg·kg-1时升高后逐渐降低。同时，SOD和CAT随施加硝态-铵态氮量增加而减低，POD活性则先升高后降低。特别地，施加不同浓度的硝态-铵态氮并没有改变GSH含量（P＞0.05；图1F）。

2.6不同形态氮对镉胁迫下龙葵氮同化的影响

与CK相比，NR和GS活性均随硝态氮施加量的增加先升后降，在施加量为25～100 mg·kg-1时无显著差异（P＞0.05）；施加不同浓度铵态氮和硝态-铵态氮时的NR，以及施加硝态-铵态氮时的GS活性随施加浓度的升高而升高，在100～400 mg·kg-1时无明显变化；而GS活性在铵态氮施加量为100 mg·kg-1时达到最大，随后逐渐降低（图2A～B）。由图2C可知，GDH活性随着3种不同形态氮施加量的增加逐渐降低。其中，GDH活性在施加不同浓度硝态-铵态氮肥时显著低于对照处理，且不同浓度氮处理间无显著性差异。

图2　不同形态氮对镉胁迫下龙葵叶片氮同化酶活性的影响Fig.2 Effect of different nitrogen forms on nitrogen assimilation enzymes of S.nigrum under Cd treatments

3　讨论

3.1铵态氮较硝态氮可显著提高龙葵的抗镉性

目前，关于Cd毒与氮交互报道多集中于Cd胁迫干扰、破坏正常氮代谢以及抑制植物生长等方面。一般认为，Cd胁迫使硝酸还原酶（NR）活性受抑制，从而干扰植物正常氮素代谢。研究表明，Cd抑制NR主要通过两条途径：Cd2+与NR疏基结合；Cd2+诱导ROS生成从而抑制NR（Hemalatha et al.，1997）。施加100～400 mg·kg-1铵态氮显著提升龙葵叶片NR活性，且维持在相对稳定水平；而施加200 mg·kg-1硝态氮时显著低于施加25～100 mg·kg-1处理（图2A），表明施加不同形态氮对Cd毒具不同程度缓解作用，而高浓度（100～400 mg·kg-1）铵态氮作用效果显著高于硝态氮和铵态-硝态氮。研究显示，3种形态氮对植株地上和地下部Cd积累量均有提高，而铵态氮的效果优于硝态氮或硝态-铵态氮，特别在施加浓度为400 mg·kg-1时最为显著。Willaert et al.（1992）研究发现，铵态氮能显著促进菠菜（Spinacia oleracea）对Cd2+吸收，同时水培下的莴苣（Lactuca sativa）在铵态氮处理下比在硝态氮处理下对Cd的累积能力更强。杨锚等（2006）认为，铵态氮增加Cd的有效性从而增加对Cd的累积，可能是由于土壤中水溶性Cd含量较高。然而，水溶性Cd含量在土壤中的有效态Cd中占有的比例却很低，植物对Cd的吸收和累积能力有限（Wang et al.，2008）。而地上部作为龙葵累积Cd的主要部位（表3～4），其积累量是衡量龙葵修复效率的关键指标。综上所述，铵态氮对龙葵的强化修复效果优于硝态氮与硝态-铵态氮，尤其是400 mg·kg-1的NH4+为龙葵镉修复的最佳浓度。

3.2氮素形态影响龙葵抗镉性可能机理

3.2.1氮素形态影响植物生长和胞外PH值

研究显示，龙葵地上部干重随施加硝态氮与铵态氮量增大而增加，地下部干重却无明显变化。而施加硝态-铵态氮则显著提高幼苗地上部和地下部干重（表2）。这些结果表明，3种不同形态的氮肥可能均是以提高植株生物量的策略以适应（镉）胁迫环境（楼玉兰等，2005；陈久耿等，2014），而400 mg·kg-1铵态氮处理对生物量的增产效果明显好于硝态氮或硝态-铵态氮。同时，Chla、Chlb 和Chl含量均随3种形态氮施量增加而增加（表5）。表明不同形态氮肥能保护叶绿体结构的完整性以及叶绿素合成过程的酶活性（Vitousek et al.，2010），降低叶绿体受到的毒害作用。究其原因，可能是由于氮有助于叶绿素含量的平衡，促进Cd胁迫下类囊体膜蛋白复合体的组装和稳定，增强水的光解和电子传递的速率（张永平等，2014；Liu et al.，2016）。而本研究中Chla/b在施加硝态-铵态氮时差异显著，施加铵态氮和硝态氮却无明显变化，其原因有待进一步研究。

对植物施加单一形态氮素，或由于植物偏好吸收某一形态氮素，由于离子吸收不平衡，会造成生长介质pH值变化。通常情况下，偏好吸收NH4+-N会使介质pH下降，偏好NO3-N会使介质pH上升；且各种金属离子在酸性条件下生物有效性高，pH值上升则有效性降低（Stratton et al.，2001）。同时，Eriksson（1990）研究表明，铵态氮产生NH4+被施入土壤后，通过硝化作用能在较短时间内使土壤pH值降低。本研究中，施加不同浓度铵态氮会降低胞外pH，提高Cd2+生物有效性，促进超累积植物龙葵对Cd离子的吸收和转运，这也与施铵态氮时其地上部Cd2+累积量显著高于硝态氮具有一致性（表4）。同时，在强酸性环境下，龙葵可能强化了质膜H+-ATPase活性，把胞质内多余H+泵出胞外，在细胞膜微小区域内形成更高电势区，从而减少金属阳离子进入细胞（Takei et al.，2002）。同时，镉离子进入植株细胞会抑制NR活性（数据未显示），NH4+在体内还原利用会产生大量H+，降低胞质pH，在一定程度上提升Cd有效性，这可能与酸性条件会激发电负性基团富集，加强与Cd2+结合使其沉淀在胞外而解除Cd毒害（Li et al.，2014）。

3.2.2氮素形态影响抗氧化系统

保护酶系统在活性氧清除、抑制膜脂过氧化等植物抗逆生理方面发挥作用。本研究中，施加不同形态氮肥较对照（CK）显著降低龙葵叶片活性氧（H2O2与MDA，图1），表明3种形态氮显著缓解Cd毒害。同时，施加不同浓度硝态氮降低叶片CAT 和POD活性，而SOD活性在施氮量50～100 mg·kg-1时上升，随后逐渐降低。施加较低浓度硝态氮作用下，SOD在催化活性氧过程中起主导作用（Liu et al.，2015），这可能是因为氮（NO3-）作为抗性基因的信号分子，增强SOD编码基因mRNA表达量（Pankovic et al.，2000），诱导同工酶Zn-SOD表达的结果。当植物根系受外界硝态氮诱导时，根系对NO3-的吸收能力迅速增加，NO3-可明显诱导TaNRT 2.1和TaNRT 2.3表达（Vidmar et al.，2000），增加氮吸收与其ROS代谢具有相关性。随施加铵态氮浓度的增加，CAT活性先升后降，POD活性逐渐增强，而SOD活性则逐渐降低。表明施加较低浓度铵态氮时，POD与CAT在催化活性氧的过程中起着主导作用；而在较高浓度下则由POD单独作用ROS清除。相似地，POD在较低浓度硝态-铵态氮施加时起主导作用。这可能是由于氮对含铁酶类（CAT、APX等）有很高的亲和性，能诱导同工酶CAT1和CAT2的表达或调节CAT与细胞色素C氧化酶（COX）等含血红素铁酶类活性（张永平等，2014）。同时，通过GSH含量的升高激活抗坏血酸-谷胱甘肽（AA-GSH）循环有效运转，然后通过鸟甘酸环化酶（GC）介导催化三磷酸鸟苷（GTP）转化为鸟嘌呤核糖苷-3'（cGMP）实现（Xu et al.，2010）。因此，施加较低或较高浓度铵态氮较硝态氮和硝态-铵态氮，显示出较高效率提升抗氧化酶（POD）活性从而缓解Cd毒害效应。

3.3.3氮素形态影响叶片氮同化

研究表明，植物吸收硝态氮是通过根细胞的质膜载体，即高亲和力转运系统（HATS-PTR）和低亲和力转运系统（LATS-NNP），以相偶联的跨膜质子梯度能量驱动，Cd胁迫显著地降低质膜P型ATPase活性。植物对氮素的吸收主要是以NO3--N的形式进入植物体内，即使用铵态氮或硝态-铵态氮都需要在土壤中经硝化作用转变为NO3--N后被植物吸收利用（Carolina et al.，2010）。NR是植物同化硝态氮过程中的关键酶和限速酶。Hernandez et al.（1996）研究表明，一定浓度的Cd能够抑制叶片的NR活性，降低根系对N的吸收和转运。本研究表明，40 mg·kg-1Cd胁迫显著降低植株NR（图2），NR活性的降低可能与植物中硝酸盐含量减少相关。另一方面，植物根系吸收的NO3--N必须在NR作用还原成NH4+-N（Gibson，2005），经过GS-GOGTA循环在体内转化成氨基酸，才能完成氨初级同化。而GS作为氮代谢中心的多功能酶，活性提高对其代谢效率起着关键性作用。Chien et al.（2000）对水稻（Oryza glaberrima）的研究表明，Cd胁迫显著降低GS活性，从而降低水稻叶片和根系对NH4+-N的累积，本试验结果也证实了该观点。GDH广泛存在于植物组织中，Cd胁迫下可补充谷氨酸库，为Cd-PCs合成提供原料。同时，GDH可实现对高浓度NH3循环解毒（NH3来自于GS活性降低及有机N降解）（Gouia et al.，2000）。本试验中，植株GDH活性在镉胁迫下显著升高，表明在Cd胁迫下植物NH3同化过程可能起着重要作用（Chugh et al.，1992）。而施加不同形态氮肥则在不同程度上缓解了Cd对植物的胁迫作用，可能由于其能够显著提高还原动力泵硝酸还原酶的活性，减少了硝酸盐的累积（陈久耿等，2014）。研究发现，随硝态氮施加浓度增大，NR与GS活性呈先升后降趋势。随施加铵态氮浓度增大，NR活性逐渐升高至稳定，GS活性先升后降，GDH活性则逐渐降低至稳定。而随着添加硝态-铵态氮浓度增大，NR和GS活性逐渐升高至稳定，缓解因Cd胁迫引起GOGAT活性所受到的抑制作用（赵新月等，2013）；而GDH在25～400 mg·kg-1处理间差异不显著（图2C）。Cd和不同形态氮引起的氮代谢变化非常复杂，可能由于水分匮乏或可利用氮和碳的改变，也可能是由于关键酶活性变化，具体原因还有待进一步研究。

4　结论

综上所述，3种形态氮素在一定程度上均能缓解Cd胁迫对龙葵幼苗的毒害效应。然而，相对于施加硝态氮和硝态-铵态氮，铵态氮可显著提高龙葵幼苗的抗镉性，且在400 mg·kg-1的NH4+时效果最佳。同时，NH4+-N提高抗镉性可能与植物叶绿素、胞外PH值、抗氧化系统及氮同化相关。因此，施加适宜浓度铵态氮能提升龙葵中的镉含量和积累量，是修复镉污染土壤的一项简单易行的农艺措施。

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Impacts of Different Nitrogen Forms on Cadmium Accumulation，Antioxidant System and Nitrogen Assimilation in Hyperaccumulator Solanum Nigrum L.

YANG Rongjie，LIU Shiliang，SONG Huixing，YANG Yanan，PAN Yuanzhi*
College of Landscape Architecture，Sichuan AgriculturalUniversity，Chengdu 611130，China

Abstract：Solanum nigrum L.has been discovered to be a Cd hyperaccumulating species，and is therefore used for phytomining and phytoextracting Cd from contaminated soils.The effects of different nitrogen forms ［（NH4）2SO4，NaNO3，NH4NO3］ on plant growth，Cd accumulation，antioxidant system and nitrogen assimilation were investigated in the hyperaccumulator plant Solanum Nigrum L.The results showed that:（1） Cd treatments （10～160 mg·kg-1） significantly impacted biomass and diameter of root and shoot，and decreased the accumulation.However，the addition of three doses of nitrogen forms significantly alleviate the toxic effects of 40 mg·kg-1cadmium，which mainly due to the promotion of shoot biomass，Cd accumulation and chlorophyll contents.Moreover，（NH4）2SO4（400 mg·kg-1） is more effective in the accumulation of biomass than others.（2） The content of leaf hydrogen peroxide （H2O2） was decreased with increasing （NH4）2SO4and NH4NO3doses，while its level was declined first and then ascended with increasing NaNO3doses.（3） Similarly，activities of catalase （CAT） and peroxidase （POD） were decreased with increasing NaNO3and NH4NO3doses，while activity of superoxide dismutase （SOD） was declined first and then ascended with increasing NaNO3doses.Interestingly，with increasing （NH4）2SO4doses，POD activity was increased significantly，suggesting that （NH4）2SO4can markedly improve its antioxidant capacity.（4） The activities of nitrate reductase （NR） and glutamine synthetase （GS） were ascended first and then declined with increasing NaNO3doses，while the GS activity was the maximum value at concentration of 100 mg·kg-1（NH4）2SO4，and then gradually decreased.In addition，activity of glutamate dehydrogenase （GDH） was decreased with the increasing of nitrogen doses of three forms.Besides，the content of GSH did not showed significant differences among different NH4NO3doses.These indicate that the enhancing effect of （NH4）2SO4on Cd extraction is more obvious than that of NaNO3and NH4NO3.That is to say，（NH4）2SO4should be the better choice on the soil Cd phytoremediation of S.nigrum，thus it could be applied to strengthen S.nigrum L.phytoremediation of Cd-contaminated soils.

Key words：Solanum nigrum L.； nitrogen forms； cadmium stress； nitrogen assimilation； antioxidant system

DOI：10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.04.024

中图分类号：X171.5

文献标志码：A

文章编号：1674-5906（2016）04-0715-09

基金项目：四川农业大学学科建设双支计划项目（03571458）

作者简介：杨容孑（1989年生），女，博士研究生，主要从事生态恢复与生态稳定性研究。E-mail:arong.jie@163.com杨容孑与刘柿良为共同第一作者

*通信作者。E-mail:scpyzls@163.com

收稿日期：2016-01-20