邓伟明　廖泽涛　黄志祥　郭欣　李天旺

强直性脊柱炎患者外周血单个核细胞踝蛋白1表达的研究

邓伟明廖泽涛黄志祥郭欣李天旺

510317 广州，广东省第二人民医院风湿免疫科(邓伟明，黄志祥，郭欣，李天旺)；510630 广州，中山大学附属第三医院风湿免疫科(廖泽涛)

【摘要】目的探讨强直性脊柱炎(AS)患者、类风湿关节炎(RA)患者及健康志愿者(HV)外周血单个核细胞(PBMC)中踝蛋白1的表达水平及其差异。方法采集AS、RA患者及HV外周血样本各30例，流式细胞术分析CD3+ T细胞及CD14+单核细胞中踝蛋白1蛋白平均荧光强度(MFI)，逆转录PCR(RT-PCR)检测PBMC中踝蛋白1 mRNA表达水平，比较组间踝蛋白1在蛋白及mRNA表达的差异。结果在CD3+ T细胞及CD14+单核细胞中，AS患者的踝蛋白1 MFI水平均高于HV和RA患者(P均<0.05)，而HV与RA患者比较差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR提示AS患者、HV及RA患者踝蛋白1 mRNA相对表达水平分别为1.37±0.22、0.26±0.05、0.27±0.06，AS患者的踝蛋白1 mRNA相对表达水平均高于HV和RA患者(P均<0.05)。结论AS患者PBMC中踝蛋白1表达水平明显高于HV及RA患者，提示踝蛋白1可能在AS发病机制中发挥作用。

【关键词】强直性脊柱炎；外周血单个核细胞；踝蛋白1；平均荧光强度；

逆转录聚合酶链反应

Mean fluorescence intensity; Reverse transcription-polymerase chain reaction

强直性脊柱炎(AS)是一种常见的炎症性系统性风湿病，其发病率及致残率均较高，但病因及发病机制至今尚未完全明确[1-2]。整合素是一类普遍存在的跨膜糖蛋白，参与细胞间及细胞与胞外基质(ECM)间的黏附及细胞信号的转导，介导包括炎症性疾病在内多种疾病的发生与发展[3]。踝蛋白1在整合素信号通路的活化过程中发挥了至关重要的调节作用。既往的蛋白质组学研究初步发现，AS患者PBMC的踝蛋白1表达上调，提示整合素信号通路可能涉及AS的发病及炎症调节[4]。故本研究拟通过流式细胞术(FCM)检测AS患者单核及T细胞中踝蛋白1蛋白平均荧光强度(MFI)，并以逆转录-PCR(RT-PCR)法检测AS患者PBMC中踝蛋白1 mRNA的表达情况，同时以健康志愿者(HV)及类风湿关节炎(RA)患者为对照，比较踝蛋白1在3组中的表达差异，初步探讨踝蛋白1在AS发病及炎症活动中的作用及其临床意义。

对象与方法

一、研究对象

纳入初诊活动期AS患者30例(AS组)，同时纳入活动期RA患者30例(RA组)。AS组患者入组标准：①年龄20～40岁；②符合1984年修订的AS纽约标准；③无其他慢性病病史；④入选前3个月内无急性感染史；⑤入组前3个月内未使用过任何缓解疾病的抗风湿药物及糖皮质激素；⑥无生物制剂使用史；⑦毕氏AS疾病活动指数(BASDAI)≥4。RA组患者入组标准：①年龄20～40岁；②诊断上满足1987年美国风湿病学会修订的RA分类标准；③为初治或病情反复的患者，近3月内未使用过糖皮质激素及其他免疫抑制剂；④疾病活动度评分(DAS28-4)均>5.1分；⑤近2月内无任何急性感染病史；⑥无其他慢性病病史。另纳入年龄20～40岁的30名HV(HV组)作对照。本研究经医院伦理委员会批准，所有入组的个体均为自愿参加试验，并于入选时签署知情同意书。

二、标本采集

对入组的每例个体，均以真空EDTA抗凝管(2 ml及4 ml各1管)于空腹状态经外周静脉采血6 ml，立刻置4℃冰箱保存备用。其中2 ml静脉血于6 h内进行免疫荧光染色处理并于当日进行FCM分析；4 ml静脉血于2 h内用于分离PBMC，并提取总RNA用于RT-PCR实验。

三、方法

1. 踝蛋白1的蛋白表达水平检测

取依地酸二钠(EDTA)抗凝全血标本100 μl，分别加入PE anti-human CD14(美国BD Biosciences)、PE-CY5 anti-human CD3(美国BD Biosciences)各5 μl混匀，经过避光孵育及离心后，加入红细胞裂解液并离心，弃去上清后充分固定，在破膜之后加入踝蛋白 1抗体(美国Santa Cruz Biotechnology)，最后加入FITC标记的二抗(美国Santa Cruz Biotechnology)，避光孵育待测。以FACS Calibur流式细胞仪(美国Becton Dickinson)检测及分析PBMC(CD14+单核细胞及CD3+T细胞)中踝蛋白1的MFI值。

2. 踝蛋白1的mRNA表达水平检测

采用RT-PCR法，将Trizol Regent(美国Introgen公司)加入PBMC裂解细胞，然后按1 ml含细胞裂解产物的Trizol加200 μl氯仿的比例加入氯仿萃取总RNA，并以异丙醇将总RNA析出后加入DEPC水溶解。按照RevertAid逆转录试剂盒(加拿大Fermentas)说明书合成模板DNA。通过Primer Premier 5.0设计引物，其中踝蛋白1基因的引物序列为：上游5′-CTGACAACAACCCTCAACGA-3′，下游5′-CTGTGGCAATGACATCTTCC-3′，踝蛋白 1基因扩增长度为1 186 bp；选用GAPDH为内参基因，其引物序列为：上游5′-TCCACCACCCTGTTGGTGTA-3′，下游5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，GAPDH基因扩增长度为452 bp。PCR反应总体积20 μl，按照2倍体积Taq Plus PCR Masker Mix(中国天根生物技术)说明书将各成分充分混合后，按照94℃预变性3 min、 94℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min，共30个循环，72℃延伸5 min。最后取PCR产物置2%琼脂糖凝胶电泳，成像仪拍摄并分析踝蛋白 1 mRNA的相对表达水平(踝蛋白 1 mRNA的光密度值/GAPDH mRNA的光密度值)。

四、统计学处理

结果

一、研究对象的临床特征

AS组30例患者，年龄(27.6±7.6)岁，男18例、女12例；RA组30例患者，年龄(30.1±5.9)岁，男12例、女18例；HV组30名，年龄(27.4±6.2)岁，男17例、女13例。3组研究对象的年龄和性别构成比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

二、PBMC中踝蛋白1的蛋白表达水平比较

在CD14+单核细胞及CD3+T细胞中， AS组踝蛋白1的MFI值均高于HV组及RA组(P均<0.05)，而HV组与RA组间比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，见表1。

表1　　　　AS、HV与RA的PBMC中

注：CD14+单核细胞中，AS组与HV组比较q=5.21、aP<0.05，AS组与RA组比较q=6.24、bP<0.05；CD3+T细胞中，AS组与HV组比较q=9.49、aP<0.05，AS与RA组比较q=10.16、bP<0.05

三、PBMC中踝蛋白1 mRNA表达水平比较

AS组、HV组及RA组PBMC中踝蛋白1 mRNA的相对表达水平分别为1.37±0.22、0.26±0.05及0.27±0.06，3组间比较差异有统计学意义(F=536.948，P<0.001)，AS组PBMC中踝蛋白 1 mRNA的相对表达水平明显高于HV组(q=37.70，P<0.05)及RA组(q=37.36，P<0.05)，而RA组与HV组比较差异无统计学意义(q=0.34，P>0.05)，见图1。

图1　AS、HV与RA组间PBMC中踝蛋白1 RT-PCR检测结果

A：踝蛋白1及内参GAPDH mRNA在PBMC中的表达情况，其中M为标记物、泳道1～4为AS患者、泳道5～8为HV个体、泳道9～12为RA患者；B：3组研究对象踝蛋白 1 mRNA定量结果

讨论

AS是一种以中轴关节受累为特征的慢性炎症性风湿病，其发病机制仍未清楚。有研究表明其发生、发展与自身炎症或免疫系统功能异常有关[5-6]。多项研究表明，单核细胞及其分泌的细胞因子在AS发病过程中起关键作用[7-8]。AS的主要临床症状是慢性炎症反应，但免疫细胞在其发病过程中的作用日益受关注，研究表明，抑制T细胞反应可以提高TNF-α拮抗剂对AS的疗效[9]。淋巴细胞在AS发病机制中发挥重要作用[10]。但其具体机制尚未明确。本研究探讨了AS、RA及HV中踝蛋白1在单核细胞、淋巴细胞的表达是否存在差异。

整合素家族是一组介导细胞间及细胞与ECM间相互作用的受体，它们不仅可识别细胞外环境，将信号传到细胞内，还可经胞内的信号调节其与配体的亲和力，这个过程也称为整合素的活化。它们参与了细胞增殖、迁移、凋亡与信号传导等生命活动的调节。严重的整合素结构改变及整合素通路异常，可导致细胞功能的改变乃至疾病的发生。整合素参与了炎症细胞的活化与迁移[10-12]。Van Damme等[13]研究显示，AS患者肠黏膜T细胞中整合素αEβ7表达增高。许多研究表明，整合素参与RA、AS疾病的发生及发展过程[14-16]。

踝蛋白1是整合素的一个重要配体，是免疫细胞踝蛋白的关键部分，在整合素介导细胞黏附过程中起关键作用。其通过与其胞内亚单位结合从而参与整合素通路的活化。在炎症细胞因子刺激下，白细胞表面的整合素受体由静止构象转换为活性构象，促使其活化并向炎症区域迁移，参与炎症性疾病的病理生理过程[17-18]。AS是一类慢性炎症性疾病，其发生、发展机制虽未完全明确，但整合素在其发病过程中的作用日益受关注。本研究通过基因及蛋白水平检测表明AS患者中踝蛋白1表达明显高于HV，提示踝蛋白1在AS发生、发展过程中起重要作用。

AS与RA是本质不同的两种疾病，但AS与RA在临床表现、病理过程及病变部位上，均存在交叉及相似的地方，对于某些早期或不典型病例，有时临床上也难以鉴别。因此，本研究中除了设立HV对照组外，同时用RA患者作为疾病对照组，以了解AS与RA患者间蛋白表达差异的情况。结果显示，在RA患者中并未发现踝蛋白1表达增高，说明AS与RA炎症的产生可能是通过不同的信号通路调节的，踝蛋白1可能是AS潜在的、具有较高特异性的疾病标志物，经进一步证实后既有可能为AS的发病机制提供新的理论依据，也有可能作为AS特异的诊断指标，用于AS的早期诊断及鉴别诊断。

综上所述，踝蛋白1在AS患者PBMC中的表达水平明显高于HV及RA患者，提示踝蛋白1可能在AS发病及炎症活动过程中起重要调节作用，但其与踝蛋白1的内在联系尚需继续深入探讨。

参考文献

[1]Braun J, van den Berg R, Baraliakos X, Boehm H, Burgos-Vargas R, Collantes-Estevez E, Dagfinrud H, Dijkmans B, Dougados M, Emery P, Geher P, Hammoudeh M, Inman RD, Jongkees M, Khan MA, Kiltz U, Kvien T, Leirisalo-Repo M, Maksymowych WP, Olivieri I, Pavelka K, Sieper J, Stanislawska-Biernat E,Wendling D, Ozgocmen S, van Drogen C, van Royen B, van der Heijde D.2010 update of the ASAS/EULAR recommendations for the management of ankylosing spondylitis.Ann Rheum Dis,2011,70(6):896-904.

[2]古洁若.应关注强直性脊柱炎诊治研究的热点.新医学, 2011,42(3): 141-143.

[3]Miyazaki Y, Vieira-de-Abreu A, Harris ES, Shah AM, Weyrich AS, Castro-Faria-Neto HC, Zimmerman GA. Integrin alphaDbeta2 (CD11d/CD18) is expressed by human circulating and tissue myeloid leukocytes and mediates Miyazaki Y, Vieira-de-Abreu A, Harris ES, Shah AM, Weyrich AS, Castro-Faria-Neto HC, Zimmerman GA. Integrin αDβ2 (CD11d/CD18) is expressed by human circulating and tissue myeloid leukocytes and mediatesinflammatory signaling. PLoS One,2014,9(11):e112770.

[4]Li T, Zheng B, Huang Z, Lu H, Lin Q, Liao Z, Lin Z, Zhao L, Wang X, Gu J. Over-expression of talin 1 and integrin-linked kinase in PBMCs of patients with ankylosing spondylitis: aproteomic study.Clin Exp Rheumatol,2010,28(6):828-835.

[5]Ambarus C, Yeremenko N, Tak PP, Baeten D. Pathogenesis of spondyloarthritis: autoimmune or autoinflammatory?Curr Opin Rheumatol,2012,24(4):351-358.

[6]Chen D, He J, Lu C, Zhou J, Fang K, Liu X, Xu L. Increased expression of T cell immunoglobulin and mucin domain 4 is positively associated with the diseaseseverity of patients with ankylosing spondylitis. Inflammation,2015,38(3):935-940.

[7]Lin S, Qiu M, Chen J. IL-4 modulates macrophage polarization in ankylosing spondylitis. Cell Physiol Biochem,2015,35(6):2213-2222.

[8]Surdacki A, Sulicka J, Korkosz M, Mikolajczyk T, Telesinska-Jasiówka D, Klimek E, Kierzkowska I, Guzik T, Grodzicki TK.Blood monocyte heterogeneity and markers of endothelial activation in ankylosing spondylitis.J Rheumatol,2014,41(3):481-489.

[9]Pang L, Wang L, Suo T, Hao H, Fang X, Jia J, Huang F, Tang J.Tumor necrosis factor-alpha blockade leads to decreased peripheral T cell reactivity and increased dendritic cellnumber in peripheral blood of patients with ankylosing spondylitis. J Rheumatol, 2008,35(11):2220-2228.

[10]Smith JA.Update on ankylosing spondylitis: current concepts in pathogenesis. Curr Allergy Asthma Rep,2015,15(1):489.

[11]Subramanian P, Mitroulis I, Hajishengallis G, Chavakis T. Regulation of tissue infiltration by neutrophils: role of integrin α3β1 and other factors.Curr Opin Hematol,2016,23(1):36-43.

[12]Wee JL, Schulze KE, Jones EL, Yeung L, Cheng Q, Pereira CF, Costin A, Ramm G, van Spriel AB, Hickey MJ, Wright MD.Tetraspanin CD37 Regulates β2 Integrin-Mediated Adhesion and Migration in Neutrophils. J Immunol,2015,195(12):5770-5779.

[13]Van Damme N, Elewaut D, Baeten D, Demetter P, Cuvelier C, Verbruggen G, Mielants H, Veys EM, De Vos M, De Keyser F.Gut mucosal T cell lines from ankylosing spondylitis patients are enriched with alphaEbeta7 integrin. Clin Exp Rheumatol,2001,19(6):681-687.

[14]岳枫, 胡波.人类白细胞抗原、信号转导和转录激活因子、整合素与自身免疫病的相关性研究进展.中国医药导报, 2015,12(14): 31.

[15]杨慧.CD147及整合素拮抗剂抑制RA患者Th17细胞分化的作用和意义.第四军医大学,2012.

[16]刘俊晓, 王嘉祺, 王志学,丁勇.黏附分子在类风湿关节炎发病机制中作用的新进展.医学综述, 2015,21(18): 3277.

[17]Degroote RL, Hauck SM, Treutlein G, Amann B, Fröhlich KJ, Kremmer E, Merl J, Stangassinger M, Ueffing M, Deeg CA.Expression changes and novel interaction partners of talin 1 in effector cells of autoimmune uveitis.J Proteome Res,2013,12(12):5812-5819.

[18]Plavina T, Hincapie M, Wakshull E, Subramanyam M, Hancock WS.Increased plasma concentrations of cytoskeletal and Ca2+-binding proteins and their peptides in psoriasispatients.Clin Chem,2008,54(11):1805-1814.

Expression of Talin 1 in peripheral blood mononuclear cell in patients with ankylosing spondylitis

DengWeiming,LiaoZetao,HuangZhixiang,GuoXin，LiTianwang.

DepartmentofRheumatologyandImmunology,GuangdongNo.2ProvincialPeople’sHospital,Guangzhou510317,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of Talin 1(TLN 1) in peripheral blood mononuclear cell (PBMC) among patients with ankylosing spondylitis (AS), rheumatoid arthritis (RA) and healthy volunteer (HV). MethodsCollect samples of peripheral blood in 30 patients with AS, HV and RA respectively. The mean fluorescence intensity (MFI) of TLN 1 in the CD3+ T lymphocytes and CD14+ monocytes were analyzed by flow cytometry. Also, the mRNA expression of TLN 1 in PBMC was detected by the reverse transcription- polymerase chain reaction (RT-PCR). The protein and mRNA level of TLN 1 were compared among AS, RA and HV groups. ResultsMFI of TLN 1 in CD3+ T lymphocytes and CD14+ monocytes of AS patients were both significantly higher than those of HV and RA patients (P<0.05), while there was no statistically significant difference between HV and RA patients (P>0.05). Moreover, the relative mRNA level of TLN 1 in patients with AS was 1.37 ± 0.22, significantly higher than that of HV and RA patients (0.05±0.27 and 0.26±0.06 respectively,both P<0.05). ConclusionTLN 1 was up-regulated in the PBMC of AS patients, indicated that TLN 1 might play an important role in the pathogenesis of AS.

【Key words】Ankylosing spondylitis; Peripheral blood mononuclear cell; Talin 1;

DOI：10.3969/j.issn.0253-9802.2016.06.006

基金项目：广东省第二人民医院引进人才科研启动基金(2014001)

通讯作者，李天旺，E-mail：litian-wang@163.com

Corresponding author, Li Tianwang, E-mail：litian-wang@163.com

(收稿日期：2016-03-10)(本文编辑：林燕薇)

·临床研究论著·