胡国恒　侯小花　李映辰　王小菊　邹婷（.湖南中医药大学第一附属医院，湖南　长沙　40007；湖南中医药大学，湖南　长沙　4008）



肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞移植对MCAO大鼠神经功能恢复及VEGF表达的影响*

胡国恒1侯小花2△李映辰2王小菊2邹婷2
（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南长沙410007；2湖南中医药大学，湖南长沙410208）

【摘要】目的探讨肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞（HUC-MSCs）移植对脑缺血损伤的神经保护机制。方法制作雄性SPF级Sprague Dawley大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型108只，随机分为3组，即模型组36只、干细胞组36只、联合组36只，各组再根据处死时间分为3 d、7 d、14 d 3个亚组；观察各组大鼠神经功能缺损评分，以及用免疫组织化学染色以及Western blot法检测脑缺血边缘区血管内皮生长因子（VEGF）的表达。结果1）干细胞组和联合组在第3天、7天、14天的神经功能缺损评分均低于同时段模型组（均P＜0.01）；联合组在第7、14天神经功能缺损均低于同时段干细胞组（P＜0.05或P＜0.01），联合组和干细胞组在第3天的神经功能缺损无明显差异（P＞0.05）；2）免疫组化法检测及Western blot法检测脑缺血边缘区VEGF的表达均提示:第3、7、14天干细胞组、联合组VEGF阳性表达均高于模型组（P＜0.01），联合组在第7、14天VEGF阳性表达高于干细胞组（P＜0.05），联合组和干细胞组在第3天VEGF的表达无差异（P＞0.05）。结论肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞移植能显著改善MCAO大鼠神经功能损伤，促进脑功能的恢复。其发挥对脑的保护作用的机制可能是通过提高内源性VEGF的表达。

【关键词】肾脑复元汤人脐带间充质干细胞脑缺血再灌注损伤血管内皮生长因子

缺血性卒中是脑血管疾病（CVD）中导致人类死亡和致残的主要原因之一，在中国的CVD中缺血性脑血管病占70%左右［1］。缺血性脑血管病是由脑主要动脉的血流短暂或持久减少而引起的一组脑组织受损的疾病。近年来，随着对人脐带间充质干细胞（HUC-MSCs）的深入研究，以及近年来国内脐带干细胞库的建立，使众多学者逐渐认识到其在组织修复中的价值及应用前景。大量研究［2-3］也证实HUC-MSCs移植的安全性。前期研究表明［4-5］HUC-MSCs和肾脑复元汤对神经功能恢复、血管内皮生长因子（VEGF）表达有促进作用。因此本实验研究肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞对MCAO大鼠神经功能恢复及VEGF表达的影响。

1　材料与方法

1.1实验动物雄性SPF级Sprague Dawley大鼠，4月龄，体质量（280±10）g，购自斯莱克景达实验动物公司，生产许可证号: SYXK（湘）2011-0003；动物合格证号:43004700001488；动物饲养于湖南中医药大学SPF级实验动物中心，许可证号:SYXK（湘）2009-0001。

1.2试药与仪器GAPDH抗体［Cell Signaling（CST），货号:5174］；VEGF（博士德生物公司，货号:BA0269）。肾脑复元汤，组成:熟地黄10 g，山茱萸10 g，山药15 g，黄芪30 g，红景天20 g，牡丹皮10 g，当归尾10 g，赤芍10 g，地龙10 g，丹参10 g，川芎10 g。药材均购自湖南中医药大学第一附属医院，并经药剂科刘红宇副主任药师鉴定为道地药材。采用自动中药煎药壶煎药:每剂一煎加水500 mL，煎汁约200 mL；二煎加水300 mL，煎汁约150 mL。二煎混合，于水浴锅内蒸发浓缩至含生药2 g/mL，4℃冷藏备用。

1.3模型制备大鼠术前24 h禁食不禁水，术前称体质量，10%水合氯醛溶液（350 mg/kg），腹腔注射麻醉并保温。用改良Zea Longa's线栓法阻断左侧大脑中动脉制作大脑中动脉闭塞（MCAO）局灶性脑缺血模型［6］。缺血时间达到120 min后，拔除线栓即形成再灌注。再灌注2 h后采用Zea Longa 5分制神经功能评分表初步评价造模情况［7］，分值在1～3分者入组。剔除标准:身体状态极差（精神状态极差，癫痫，严重呃逆、腹泻等）；未到时间点死亡。因大鼠死亡致样本量不足时随机替补。

1.4分组与给药选取造模成功的大鼠，将模型大鼠随机分成模型组36只，干细胞组36只，联合组36只，各组再根据处死时间分为3、7、14 d 3个亚组，每组12只，其中免疫组化法6只，Western blot法检测6只。各组于造模后24 h开始给药，联合组和干细胞组大鼠局灶性脑缺血2 h再灌注1 d后，经尾静脉注入人脐带间充质干细胞，每只大鼠接受10 μL（5×104/μL），模型组经尾静脉注入生理盐水。模型组及干细胞组分别灌胃生理盐水（10 mL/kg），联合组灌胃等量肾脑复元汤。灌胃每日1次，直至处死。

1.5标本采集与检测

1.5.1mNSS评分各组大鼠在造模前24 h、造模成功后24 h、处死前采用改良大鼠神经功能缺损严重程度评分量表（m-NSS）［8］分别进行评分。标准mNSS量表包括4大项，总分18分，完全正常=0分，完全功能缺失=18分。每只动物观察两次计算平均数。

1.5.2脑组织VEGF检测MCAO模型鼠分别于移植后3、7、14 d取大鼠处死。予10%水合氯醛（0.35 mL/ 100 g）腹腔注射对大鼠麻醉后，剪开腹腔及胸腔，暴露心脏及腹主动脉，夹闭腹主动脉，9号注射针头从心尖部刺入左心室，剪开右心耳；先用100 mL生理盐水灌注至右心耳冲出清透液体后，换成4%多聚甲醛灌注约300 mL，断头取脑，置于4%多聚甲醛内固定24 h，常规石蜡切片，行免疫组织化学染色检测VEGF以及Western Blot法检测VEGF。HE染色后每组检测8张切片，分别选取缺血海马区5个互不重叠的视野，在光镜（×100）下观察各组梗死区神经细胞的情况。免疫组织化学染色检测VEGF时，每组检测8张切片，分别选取缺血海马区5个互不重叠的视野，采用IPP6.0软件进行图像分析，测定阳性细胞的平均光密度值。平均光密度值高，则细胞阳性染色强度高。Western Blot法检测VEGF时，采用IPP6.0软件对条带进行图像分析，VEGF蛋白表达的指标以VEGF产物与GAPDH产物条带灰度值的比值（即相对灰度值）来表示，相对灰度值高，则说明VEGF蛋白表达越高。

1.5.3HUC-MSCs的分离、培养、鉴定和标记超净工作台上剥去脐带动静脉，PBS洗去残留血液，用无菌眼科剪反复剪切成1 mm小块为止；参照秦力维等［9-10］的方法用组织块法培养HUC-MSCs。采用流式细胞仪分别对细胞表面标记物进行检测，按照国际细胞疗法协会关于间充质干细胞的鉴定标准，要求CD73、CD105、CD90、CD29阳性表达率超过95%，CD45、CD34、CD14、CD79a/CD19和HLA-DR的表达率低于2%；台盼蓝染色检测细胞活率超过85%。此外，参照Li等［11-12］的方法，将培养细胞鉴定具备分化成脂、成骨的能力。

1.6统计学处理采用SPSS19.0统计软件处理。实验数据经正态分布检验后以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1各组不同时间点mNSS比较见表1。缺血再灌注后1 d，3组大鼠的mNSS差异均无统计学意义（P＞0.05），随后各组分值逐渐降低，在缺血再灌注后3 d，联合组和干细胞组mNSS差异均无统计学意义（P＞0.05），但两组的评分均低于模型组（P＜0.05）。随后在7、14 d，联合组大鼠的mNSS评分均明显低于其他两组（P＜0.05或P＜0.01）。说明肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞能明显改善脑缺血再灌注后神经功能恢复。

表1　各组不同时间点mNSS比较（分，

表1　各组不同时间点mNSS比较（分，

与模型组同时期比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与干细胞组同时期比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组别　n　术后3 d术后7 d术后14 d模型组　6　9.0±0.9　7.7±0.8　5.8±0.8术前1 d术后1 d 0　9.5±1.0干细胞组　6　7.8±1.0*5.8±0.4**4.2±0.8**0　9.5±1.4联合组　6　0　9.3±1.4 7.5±1.0**4.8±0.8**△3.0±0.6**△△

2.2各组梗死区神经细胞HE染色见图1。术后第14日，大鼠断头取脑，固定后行HE染色，各组均可见梗死区，神经细胞明显减少，可见大量神经细胞变性、坏死，核固缩、碎裂、溶解。联合组及干细胞组病理变化均较模型组轻，神经细胞变性、坏死数量明显变少。联合组与干细胞组比较，联合组病理变化较干细胞组轻，神经细胞变性及坏死数量明显减少。3组均未发现肿瘤细胞及异形细胞。模型组中可见大量神经细胞变性、坏死，干细胞组可见中等量神经细胞变性、坏死，联合组仅见少量神经细胞变性、坏死。

图1　各组缺血海马区（HE染色，100倍）

2.3免疫组化法及Western Blot法检测VEGF表达见表2，图2，图3。随着时间的延长，各组VEGF平均光密度逐渐升高，模型组在术后7 d平均光密度增长达高峰，随后逐渐下降。干细胞组和联合组随着时间的延长，VEGF平均光密度逐渐升高，术后3 d，两组VEGF平均光密度无明显差异（P＞0.05），但与模型组比较均有明显升高（均P＜0.01）；7 d和14 d组，联合组均较其他两组VEGF平均光密度明显升高（均P＜0.01）；7 d和14 d组，干细胞组VEGF平均光密度较模型组明显升高（均P＜0.01）。说明肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞可以促进VEGF的表达。Western Blot法检测VEGF检测显示其灰度值结果同上。术后3 d，联合组和干细胞组VEGF相对灰度值无明显差异（P＞0.05），但与模型组比较均有明显升高（均P＜0.01）；7 d和14 d组，联合组均较其他两组VEGF相对灰度值明显升高（均P＜0.01）；7 d和14 d组，干细胞组VEGF相对灰度值较模型组明显升高（均P＜0.01）。说明肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞可以促进VEGF的表达。

表2　各组不同时间点VEGF表达比较

表2　各组不同时间点VEGF表达比较

组别　时间　免疫组化法　Western-Blot法模型组　术后3 d　0.25±0.01　0.34±0.01 （n＝6）　术后7 d　0.27±0.01　0.36±0.01术后14 d　0.24±0.01　0.33±0.01干细胞组　术后3 d　0.28±0.01**　0.38±0.01**（n＝6）　术后7 d　0.30±0.01**　0.50±0.01**术后14 d　0.30±0.01**　0.50±0.01**联合组　术后3 d　0.29±0.01**　0.39±0.01**（n＝6）　术后7 d　0.32±0.01**△△　0.53±0.01**△△术后14 d　0.33±0.01**△△　0.70±0.01**△△

图2　各组VEGF阳性细胞表达（400倍）

图3　各组Western-Blot法检测VEGF表达

3　讨论

局灶性缺血时，VEGF可在不同组织细胞中表达，进而促进血管发生，以保证缺血组织在恢复过程中微循环的建立。VEGF不仅是一种强效的有丝分裂原，可直接作用于内皮细胞，诱导血管再生，并增加血管通透性，同时还是一种诱导血管形成和影响血管通透性的因子［13］。VEGF在人和动物胚胎发育阶段呈高水平表达，介导生理过程的血管生成。正常成年组织中表达量很少，但在肺、肾、脑等组织中仍有一定低水平的表达。而在某些病理条件下，如缺血、缺氧时，VEGF表达明显增加，尤其以脑组织中的VEGF表达升高明显。卒中发生后，缺血半暗带区会产生大量VEGF等与血管新生有关的生长因子，促进血管新生［14］。有研究认为，VEGF对CNS的作用远不局限于调节血管的形成与生长，在脑缺血发生时，VEGF对神经系统具有多重保护作用，涉及血管形成、促进神经发生、直接的神经营养和神经保护作用及抗凋亡等多种机制［15］。

本实验研究显示，脑缺血再灌注损伤后大鼠自身VEGF有一定表达，人脐带间充质干细胞移植能够升高VEGF的表达水平，而肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞移植治疗能够显著提高VEGF的表达水平。与模型组比较，肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞能促进脑缺血再灌注大鼠神经功能损伤的恢复，因此证明肾脑复元汤联合人脐带间充质干细胞移植治疗能够发挥对脑的保护作用，其发挥作用的可能途径是通过提高内源性VEGF的表达，从而促进缺血区新生血管的生成。与单纯干细胞移植治疗组比较，联合组对MCAO大鼠神经功能恢复的效果更显著，因此证明肾脑复元汤和外源性MSCs移植治疗脑缺血再灌注损伤具有整体协同作用。两者联合作用促进内源性VEGF表达的具体机制有待进一步研究。

术后3 d，各组VEGF平均光密度开始逐渐升高。说明在脑缺血损伤的早期机体即开始发挥对损伤脑组织的修复作用。在第3天时，联合组和干细胞组模型组VEGF的表达明显高于模型组，说明联合组和干细胞组在脑缺血损伤早期即可更大力度发挥对损伤脑组织的修复作用。模型组在术后7 d平均光密度增长达高峰，随后该组VEGF平均光密度逐渐下降，干细胞组第7日，14 d VEGF的表达逐渐处于平台期，但联合组在第7日至第14日VEGF的表达仍呈现增长趋势，说明联合组能更大程度促进VEGF的表达，进一步发挥对损伤脑组织的修复作用，促进血管新生。其原因可能是肾脑复元汤能够延长HUC-MSCs在体内存活的时限，从而使内源性VEGF的表达持续升高。

本实验HE染色提示联合组大鼠脑组织的神经细胞变性相对较轻，其可能原因是联合组促进了内源性VEGF的表达，从而促进神经细胞的新生。另外本实验中未出现因肾脑复元汤联合HUC-MSCs移植治疗引起的明显不良反应，组织学行HE染色观察各组未见到明显肿瘤细胞及异形细胞。因此本实验也从侧面验证了肾脑复元汤联合HUC-MSCs移植治疗脑缺血再灌注损伤近期没有明显的致瘤性，当然中药联合干细胞移植治疗的远期疗效及致瘤性尚需进一步研究。

参考文献

［1］王拥军，张苏明.中国缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作二级预防指南2010［J］.中华神经科杂志，2010，43（2）: 154-160.

［2］何君，李洋，陈威，等.人脐带间充质干细胞静脉输注小鼠的安全性［J］.中国比较医学杂志，2013，23（9）:36-41.

［3］张培培，刘慧纯，阎晓玲，等.脑缺血再灌注损伤大鼠尾静脉移植脐带间充质干细胞的安全性［J］.中国组织工程研究，2012，16（19）:2581-2584.

［4］Liao WB，Zhong J，Yu JX.Therapeutic benefit of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells in intracerebral hemorrhage rat: implications of anti-inflammation and angiogenesis［J］.Cell Physiol Biochem，2009，24:307-316.

［5］胡国恒，李映辰，邹婷，等.肾脑复元汤对MCAO大鼠炎症因子及神经营养因子表达的影响［J］.中药药理与临床，2015，31（2）:81-85.

［6］Park KI，Ourednik J，Ourednik V.Global gene and cell replacement strategies via stem cells［J］.Gene Ther，2002，9 （10）:613-624.

［7］Reyes M，Lund T，Lenvik T.Purification and exvivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells［J］.Blood，2001，98（9）:2615-2625.

［8］Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem clls［J］.Science，1999，284 （5411）:143-147.

［9］秦力维，张宁坤，郭建巍，等.人脐带间充质干细胞的高效分离及对小鼠免疫功能的影响［J］.转化医学杂志，2014，3 （6）:333-336.

［10］李铎，石钏，洪敬欣，等.组织块法分离人脐带间充质干细胞的研究［J］.中国医药导报，2011，8（24）:19-22.

［11］Li DH，Wang CH，Shan W.Human amnion tissue injected with human umbilical cord mesenchymal stem cells repairs damaged sciatic nerves in rats［J］.Neural Regen Res，2012，7 （23）:1771-1778.

［12］何绍清，罗振宇，刘秋英，等.人脐带间充质干细胞分离培养及向脂肪与成骨细胞的分化［J］.中国组织工程研究与临床康复，2010，14（14）:2492-2496.

［13］周江，郭靖涛，王福华，等.血管内皮生长因子与急性心肌梗死介入治疗术后再狭窄研究进展［J］.河北医学，2014，20（12）:2138-2141.

［14］Liman TG，Endres M.New vessels after stroke: postischemic neovascularization and regeneration［J］.Cerebrovasc Dis，2012，33:492-499.

［15］栗世方，王任直，李桂林.血管内皮生长因子治疗脑缺血实验研究进展［J］.中国医学科学院学报，2005，27（1）:115-119.

·研究报告·

Effect of Shennao Fuyuan Tang Combined with Transplantation of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells on the Recovery of Neural Functional and Expression of VEGF in Cerebral Ischemic Rats

HU Guoheng，HOU Xiaohua，LI Yingchen，et al.The First Affiliated Hospital of Hunan University of TCM，Hunan，Changsha 410007，China.

【Abstract】Objective: To study the nerve protecting function of Shennao Fuyuan Tang combined with transplantation of human umbilical cord mesenchymal stem cells（HUC-MSCs）on the cerebral ischemic rats.Methods: MCAO models of rats were made and randomly divided into the model group（n=36），HUC-MSCs transplantation group（HUC-MSCs group）（n = 36）and Shennao Fuyuan Tang combined with HUC-MSCs transplantation group （the combined group）（n=36），and these groups were separately divided in to another 3 groups by execution time （3rd，7th，14thday）.The Neurological Severity Scores（NSS）were observed，and the expression of VEGF was detected with immunohistochemical staining and Western blot methods.Results: 1）NSS on 3rd，7thand 14thday of both HUC- MSCs group and the combined group were lower than those of the model group at the same time section （P＜0.01）.NSS of the combined group on 7thand 14thday were lower than those of the HUC-MSCs group at the same time section（P＜0.05 or P＜0.01）.There was no significant difference in NSS between the combined group and the HUC-MSCs group in 3rd day（P＞0.05）.2）The expression of VEGF in edge area of cerebral ischemia with immunohistochemical staining and Western blot methods to detect showed that the expression of VEGF of both the HUC-MSCs group and the combined group on on 3rd，7thand 14thday was higher than that of the model group（P＜0.01）.The expression of VEGF of the combined group on 7thand 14thday was higher than that of the HUC-MSCs group at the same time section（P＜0.05）.There was no significant difference in the expression of VEGF between the combined group and the HUC-MSCs group in 3rd day（P＞0.05）.Conclusion: Shennao Fuyuan Tang combined HUC MSCs transplantation can significantly improve the nerve function damage of MCAOrats，and promote the recovery of brain function.It plays the role of the protection of brain mechanism probably by enhancing endogenous VEGF expression.

【Key Words】Shennao Fuyuan Tang；Human umbilical cord mesenchymal stem cells（HUC-MSCs）；Ischemia stroke；VEGF

中图分类号:R285.5

文献标志码:A

文章编号:1004-745X（2016）01-0004-04

doi:10.3969/j.issn.1004-745X.2016.01.02

*基金项目：国家自然科学基金项目（81273751）

通信作者△（电子邮箱：504771117@qq.com）

收稿日期（2015-10-07）