王　茂，何彦霏，刘　丹，樊　皎，苏　青,2△

1.成都医学院 药学院(成都　610083)；2.成都中医药大学(成都　610075)

壳聚糖创面喷雾剂处方筛选及对大鼠创伤愈合作用的研究*

王茂1，何彦霏1，刘丹1，樊皎1，苏青1,2△

1.成都医学院 药学院(成都610083)；2.成都中医药大学(成都610075)

【摘要】目的筛选壳聚糖伤口护理膜处方，并评价其促进创伤愈合的效果。方法采用酸碱性、透气性和成膜性为评价指标，L9 (34) 正交表进行正交试验，筛选出壳聚糖创面喷雾剂最佳处方。制备SD大鼠创伤模型，以存活率、创面愈合时间、创面愈合率评价其促进伤口愈合的能力。结果筛选出的最佳处方组成为：壳聚糖0.1 g、乳酸0.05 mL、水20 mL和乙醇10 mL。实验组、对照组和空白组恢复创伤当天体质量的时间分别为(7.14±1.21) d、(7.00±1.15) d和(10.00±2.45) d，与空白组相比差异均有统计学意义(P=0.018和P=0.013)；实验组、对照组和空白组创面愈合时间分别为(11.17±0.75) d、(12.33±0.82) d和(14.00±0.89) d，与空白组相比差异均有统计学意义(P=0.012和P=0.038)；与空白组相比，实验组和对照组在伤后各时间点的创面愈合率均明显提高(P<0.05)。结论自制壳聚糖创面喷雾剂能明显缩短伤口愈合时间，促进创面愈合。

【关键词】壳聚糖；处方筛选；创伤；愈合

壳聚糖(chitosan)是甲壳素的脱乙酰产物，是迄今所发现的唯一天然碱性多糖，具有良好的生物相容性和可降解性，还具有抗菌、消炎、止血、减少创面渗出、促进创伤组织再生、修复、愈合等作用，是促进各类创面愈合的理想材料之一[1-2]。本研究研制了壳聚糖创面喷雾剂，该制剂喷洒于创面后可形成透气保湿的隔离膜，保护创面并形成湿性环境，同时还具有抗渗出、防粘连、止血、抗感染和促进伤口愈合等作用，尤其适合人体腔道等难以包扎部位的伤口治疗。本研究对壳聚糖创面喷雾剂处方进行优化，筛选出最优处方，并评价其促进创面愈合的能力。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1试剂与仪器药品稳定性试验箱购自重庆永生实验仪器厂，壳聚糖购自上海伯奥生物科技有限公司，乳酸购自成都市科龙化工试剂厂，乌拉坦购自成都市科龙化工试剂厂。

1.1.2实验动物SD大鼠21只，雌、雄各半，体质量(240±10) g，由四川大学华西医院动物实验中心提供(动物合格证号：川实动管质第70号)。

1.2方法

1.2.1壳聚糖创面喷雾剂制备 称取处方量壳聚糖于烧杯中，加入定量乳酸和水，搅拌至溶解，加入无水乙醇和水至全量，装入喷瓶中。使用前于烘箱85 ℃灭菌1 h，室温放置24 h，如此反复灭菌3次即得。

1.2.2处方筛选评价指标测定与计算微酸环境能抑制创面细菌生长，创面pH值4.5～6.5对伤口愈合有利。酸碱性评分标准为：酸碱性得分(A)=0(pH值<4.5或pH值>6.5)，酸碱性得分=10(4.5≤pH值≤6.5)。

精密移取5 mL乙酸乙酯于称量瓶中，用称量纸覆盖瓶口，将 0.1 mL喷雾剂均匀涂抹于称量纸上，称重。另取同规格称量瓶同法操作，但不涂抹喷雾剂。将以上两组称量瓶同时置于恒温恒湿箱中静置24 h(温度为25 ℃，相对湿度为32%)后取出称重，计算各自的失重，以二者失重的比值作为透气性评价指标(B)。

预实验中发现个体差异对皮肤成膜时间影响较大，因此通过室温和皮肤成膜时间两个指标综合评价。将称量纸覆盖于称量瓶口(50 mm×30 mm，直径×高度)并固定，精密移取0.1 mL喷雾剂至称量纸上涂抹均匀，立即置于恒温恒湿箱中静置，记下时间为T1，待喷雾剂挥干成膜后记下时间为T2，(T2-T1)即为室温成膜时间(C)。精密移取0.1 mL喷雾剂均匀涂抹于人体手背，记下时间为t1，待喷雾剂挥发成膜后记下时间为t2，(t2-t1)即为皮肤成膜时间(D)。

1.2.3创伤造模与分组大鼠用乌拉坦腹腔注射麻醉后，四肢固定，去除背部毛发(注意不要损伤皮肤)。在大鼠背部脊柱一侧1 cm处标记一个直径为1.8 cm的圆为造模区，酒精消毒，用镊子将皮肤提起沿标记剪去皮肤，造成一个全层皮肤切除开放创面，深达肌肉。造模后，大鼠随机分为实验组(予以壳聚糖创面喷雾剂)、对照组(予以立见伤口护理膜喷雾剂)和空白组，每组各7只。实验组和对照组每日定时以距离大鼠创面15 cm喷雾给药，每次喷洒3次，给药量约为0.3 mL，空白组不做任何处理。温度为21 ℃，湿度为55%的环境下使用无菌垫料单笼喂养，以做切口当天记为0天，次日记为第1天， 观察各项指标。

1.2.4创面愈合率首次给药后第4、8、12天用称量纸覆盖于创面上描记创面大小，扫描，用Image J软件进行分析取得面积数据，计算创面愈合率= (原始创面面积一未愈合创面面积)/原始创面面积×100%。

1.3统计学方法

2结果

2.1正交试验筛选处方

为优化壳聚糖、乳酸、水和乙醇在处方中的组成，以综合评价为参考指标，采用L9(34) 正交表安排实验，根据前期预实验，每个因素选择3个水平(表1)。

表1　处方筛选正交实验

由正交试验结果和方差分析可知，4种因素中对综合性能影响的大小顺序为:壳聚糖>水>乙醇>乳酸，最优处方为：A1B1C2D3；按最优处方进行验证实验，所得处方各性能指标皆优(表2和表3)。

表2　正交试验结果

表3　方差分析表

注：F0.1(2,2)=9, F0.05(2,2)=19, F0.01(2,2)=99

2.2创伤愈合情况及存活率

造模后大鼠基本情况良好，第1天精神沉郁，活动少，第2天开始逐渐恢复正常，实验组和对照组均比空白组活跃，恢复更快。创伤初期所有大鼠体质量均急速下降，之后逐渐回升，实验组、对照组和空白组分别在(7.14±1.21) d、(7.00±1.15) d和(10.00±2.45) d恢复创伤当天体质量，与空白组相比，差异均有统计学意义(P=0.018和P=0.013)。实验组和对照组全部存活，存活率为100%；空白组死亡1只，存活率为83.33%，3组存活率比较，差异无统计学意义(P=0.354)。

2.3创面愈合时间

实验组、对照组和空白组创面愈合时间分别为(11.17±0.75) d、(12.33±0.82) d和(14.00±0.89) d。与空白组相比，实验组和对照组伤口愈合时间明显缩短，差异均有统计学意义(P=0.012和P=0.038)。

2.4创面愈合率

与空白组相比，实验组和对照组在各时间点的创面愈合率均明显提高，差异均有统计学意义(P<0.05)；实验组和对照组的创面愈合率比较，差异无统计学意义(P>0.05)(表4)。

表4　各组创面愈合率

注：与空白组相比，*P<0.05

3讨论

壳聚糖作为一种阳离子多糖，具有抗菌、消炎、止血、减少创面渗出和促进创伤组织再生、愈合等作用，是促进创面愈合的理想材料之一。目前不少研究[3-6]将壳聚糖制备成膜剂、凝胶剂和敷料等用于创面愈合的治疗，本研究将其制备成喷雾剂，处方简单，使用方便，尤其适合人体腔道等难以包扎部位的伤口治疗，为壳聚糖新制剂开发提供参考。

壳聚糖喷雾剂促进创面愈合的原因为它能在皮肤表面形成一层黏稠的液膜，该液膜能抵抗外界细菌感染，并形成湿性环境[7-8]，促进伤口愈合。本研究采用酸碱性，成膜性和透气性三个指标综合考察其质量，为完善该制剂的质量评价提供参考。

测量透气性时，挥发溶剂考察了乙酸乙酯、乙醇、水、乙醚以及正丁醇等。由于处方中有水和乙醇，为避免相互影响，故排除水和乙醇；乙醚挥发性强，但对人有毒；正丁醇毒性较小，但挥发性不强；乙酸乙酯无毒，易挥发，符合要求。另外实验中发现处方中的壳聚糖在高温下容易分解变性，故选择低温间歇灭菌方式。

参考文献

[1] 张步宁,崔英德,陈循军,等.甲壳素/壳聚糖医用敷料研究进展[J].化工进展,2008,27(4):520-526.

[2] 蒋玉燕,毕忆群,蒋建国.壳聚糖生物流体敷料膜对各类创面愈合的临床效应[J].中国组织工程研究与临床康复,2007,11(1):164-166.

[3] 袁丹波.壳聚糖抗菌生物医用膜在烧伤创面中的临床应用[J].微生物学免疫学进展,2012,40(1):35-37.

[4] 成冲,范黎,李飞,等.壳聚糖/魔芋葡甘露聚糖复合膜体内外促创面愈合研究[J].现代生物医学进展,2012,12(13):2418-2421.

[5] 颜姝,张重威,龙文昕,等.甲壳质及其衍生物壳聚糖在医学中的应用研究[J].中国医学工程,2015(11):211-212.

[6] 邓春梅,何兰珍,杨丹,等.壳聚糖-明胶海绵伤口敷料的毒理学评价[J].毒理学杂志,2007,21(1):76-77.

[7] Hinman CD,Maibaeh H.Effect of air exposure and occlusion on experimental human skin wounds [J].Nature,1963,194(12): 377-378.

[8] Winter GD.Formation of the scab and the rate of epithelisation of superficial wounds in the skin of the young domestic pig.1962[J].J Wound Care,1995,4(8): 366-367.

Formulation Optimization and Pharmacodynamics Research of Chitosan Wound Sprays

WangMao1,HeYanfei1,LiuDan1,FanJiao1,SuQing1,2△.

1.SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China;2.SchoolofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu610075,China

【Abstract】ObjectiveTo develop an optimal prescription of chitosan wound sprays and to study its efficacy in promoting wound healing. MethodsL9 (34) orthogonal table was used to screen optimal prescription with pH, permeability and film-forming properties as evaluation indicators. SD rat would model was prepared and its ability to promote wound healing was evaluated in terms of survival rate, healing time, healing rate, etc. ResultsThe optimal formulation consisted of chitosan 0.1 g, lactic acid 0.05 mL, water 20 mL and ethanol 10 mL. The time of body weight recovery in experimental group, control group and blank group were (7.14±1.21) d, (7.00±1.15) d and (10.00±2.45) d respectively. Compared with blank group, the differences were statistically significant (P=0.018, P=0.013). The recovery time of experimental group, control group and blank group were (11.17±0.75) d, (12.33±0.82) d and (14.00±0.89) d respectively. Compared with blank group, the differences were statistically significant (P=0.012 and P=0.038). Compared with the blank group, the wound healing rate of experimental group and control group were obviously improved in 4, 8 and 12 d, the differences were statistically significant (P<0.05). ConclusionThe self-made chitosan wound sprays can significantly shorten the healing time and promote wound healing.

【Key words】Chitosan; Prescription screening; Wound; Healing

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.01.005

*基金项目：省级大学生创新创业训练计划项目(No：201313705015)；成都医学院“大学生创新实验计划”( No：CXXS201320)；四川省教育厅重点项目(No：14ZA0232)

通信作者：△苏青，E-mail:suqing@cmc.edu.cn

【中图分类号】R641

【文献标志码】A

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160221.2059.050.html

·论著·