张凡喜　张健民　黄晓龙　周玉峰　陈鹏

Dickkopf-1在脑出血大鼠神经元凋亡中的作用及机制研究

张凡喜张健民黄晓龙周玉峰陈鹏

400020解放军第三二四医院神经外科

摘要:目的探讨Dickkopf-1(DKK-1)在脑出血大鼠神经元凋亡中的作用及机制。方法采用随机数字法将40只成年雄性SD大鼠分成对照组(n=13)、假手术组(n=13)及脑出血组(n=14)。通过颅内注射自体外周血制作脑出血模型。采用平衡木行走实验和肌力测验进行脑出血模型评估，并利用Real-time PCR和Western blot检测大鼠脑组织中Bcl-2、Bax、p-Akt、Akt及DKK-1蛋白和mRNA表达水平。分离培养原代大鼠皮质神经元，分为对照组、空载体组、DKK-1过表达组、BTBD10(Akt磷酸化激活剂)过表达组，检测细胞中DKK-1表达水平和Akt磷酸化水平，利用流式细胞术检测各组细胞凋亡。 结果脑出血组大鼠平衡木行走得分高于对照组和假手术组(P<0.05)，而肌力测验评分低于对照组和假手术组(P<0.05)。与对照组和假手术组比较，大鼠脑出血部位脑组织Bcl-2表达降低(P<0.05)，而Bax表达则升高(P<0.05)，p-Akt表达水平下降(P<0.05)，DKK-1表达水平上升(P<0.05)。DKK-1过表达组神经元凋亡率及p-Akt表达水平均高于空载体组和对照组(均P<0.05)。Akt磷酸化激活剂BTBD10过表达组p-Akt水平、Bcl-2蛋白表达高于对照组和空载体组，而Bax蛋白表达则低于对照组和空载体组。BTBD10过表达组神经元存活率高于对照组和空载体组(均P<0.05)，且BTBD10和DKK-1共转染组大鼠神经元存活率高于DKK-1转染组(P<0.05)。结论DKK-1可能通过抑制Akt的磷酸化促进出血性脑卒中大鼠神经元的凋亡。

关键词:脑出血；DKK-1；细胞凋亡；Akt

脑出血约占全部脑卒中的20%～30%，全球每年有约200万人发病，且中国人的发病率较白种人高[1]。脑出血对脑部的损伤最初是通过对邻近组织机械压迫引起，随后发生由脑水肿、炎性反应和氧化刺激所引起的继发性损伤。在氧化刺激过程中，活性氧通过与其他胞内分子相互作用引起神经细胞凋亡[2]。Dickkopf家族蛋白(DKKs)多为Wnt信号的拮抗剂，有研究结果显示DKK-1与神经退行性病变有关[3]，其能够促进1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的神经细胞凋亡[4]。本研究通过建立大鼠脑出血模型并分离大鼠皮质神经元细胞，初步探讨了DKK-1在脑出血中的作用及相关机制。

1材料和方法

1.1实验动物成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，平均体质量为250 g；一日龄新生SD大鼠10只，均由重庆医科大学动物实验中心提供。利用随机数字法将40只SD大鼠分为对照组(n=13)、假手术组(n=13)和脑出血组(n=14)。

1.2主要试剂及仪器马血清、葡萄糖、HEPES、谷氨酰胺、青霉素和链霉素购自美国Sigma公司，水合氯醛、DMEM培养基、TRIzol试剂盒、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒购自美国Invitrogen公司，抗DKK-1、抗Bcl-2、抗Bax、抗磷酸化Akt(p-Akt)、抗Akt和抗β-actin抗体、DKK-1 siRNA购自美国Santa Cruz公司，X-tremeGENE siRNA转染试剂、FuGENE HD 转染试剂盒为美国Roche公司产品，硝酸纤维膜为德国GE Healthcare公司产品，MTT、ECL试剂盒购自江苏碧云天公司。其他包括G418(Genview，Carlsbad，Calif)及SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Takara，大连)。

1.3方法

1.3.1大鼠脑出血模型制备：以腹膜内注射10%(质量浓度)水合氯醛麻醉大鼠，以碘附消毒头顶皮肤，纵向切开约1.5 cm切口，暴露颅骨，在前囟后1.40 mm，矢状缝向右3.20 mm处开颅钻孔(直径1 mm)。断尾收取自体全血(50 μL)，无菌注射器注入右侧尾状壳核。留针10 min后，缝合皮肤切口，并将大鼠置于12 h光照-黑暗循环的无菌条件中饲养。假手术组仅插入注射器，不注射自体血，对照组小鼠不做任何处理。分别采用Western blot和Real-time PCR方法检测造模术后0、6、12、24、72、120 h大鼠血肿周围脑组织中 Bcl-2、Bax、pAkt、Akt及DKK-1 和表达水平。

1.3.2脑出血模型评估：(1)平衡木行走试验：脑出血术后3 h测定运动整合及协调能力，平衡木长80 cm，宽 2.5 cm，平放在距离地面高10 cm 处。按Feeney等[5]评分标准：0分：穿过平衡木，不会跌倒；1分：穿过平衡木，跌倒机会少于50%；2分：穿过平衡木，跌倒机会大于50%；3分：能穿过平衡木，但受累的瘫痪侧后肢不能帮助向前移动；4分：不能穿过平衡木，但可坐在上面；5分：将大鼠放在平衡木上会掉下来。正常为0分，1～4 分视为造模成功。(2)肌力测验：术后3 h进行大鼠肌力测验，直径0.15 mm铁丝绳，长46 cm，置于距地面70 cm高度上，其下放泡沫箱。将大鼠两个前爪放在绳上，放开，记录大鼠在绳上的时间。0分：挂在绳上 0～2 s；1分：挂在绳上3～4 s；2分：挂在绳上5 s；3分：挂在绳上5 s，将后腿放在绳上。肌力测验3分为正常，低于3分视为运动功能受损。

1.3.3原代大鼠皮质神经元的分离和培养：取一日龄新生SD大鼠大脑皮质，胰酶消化后获取单细胞悬液，以每孔2×106个细胞接种于6孔板中。培养基为含10% (体积分数)马血清、25 mmol/L葡萄糖、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L谷氨酰胺、100 IU / mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素的DMEM培养基。于37 ℃、含5%(体积分数)CO2的培养箱中培养，每3 d更换1次培养液。将培养的原代大鼠皮质神经元分为对照组、空载体组、DKK-1过表达组、BDBT10(Akt磷酸化激活剂)过表达组、DKK-1过表达组以及DKK-1+BDBT10共转染组。分别采用Western blot和Real-time PCR方法检测各组细胞 Bcl-2、Bax、pAkt、Akt及DKK-1蛋白和mRNA表达水平。

1.3.4脑出血大鼠大脑取材：采用10%(质量浓度)水合氯醛腹腔注射将大鼠过量麻醉，75%(体积分数)乙醇消毒。断头后剪开头皮去除周围肌肉，小心打开颅骨取出大鼠全脑。去除脑膜及血管后，取血肿周围脑组织，将取出的大小约 1 mm3的脑组织迅速冷冻备用。

1.3.5Western blot：分别提取大鼠脑组织和细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后将蛋白转移至硝酸纤维膜。将膜置于含10%(质量浓度)脱脂奶粉PBS中4 ℃封闭1 h。加入一抗孵育1～2 h，TBST清洗之后加入HRP标记的二抗孵育30 min，TBST洗膜，采用ECL试剂盒显色，胶片拍照，用凝胶图像分析系统对蛋白条带进行分析。所有实验均重复3次。

1.3.6Real-time PCR：使用TRIzol试剂盒提取组织或细胞总RNA。使用Oligo-dT引物和PrimeScript®RT 试剂盒将总RNA反转录成cDNA。DKK-1引物：5′-CCAGACTCTTGACAACTACC-3′(顺式)， 5′-GATGCTTTCCTCAATTTCCC-3′(反式)；以β-actin为内参。引物由上海生工生物公司合成。采用Real-time PCR 试剂盒SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ，反应总体系为25 μL，含cDNA 20 ng、引物0.4 μmol/L。反应条件：95℃ 5 min预变性；94℃ 20 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 进行40个循环。反应在Bio-Rad iQ5 实时定量PCR仪中进行，目的基因和β-actin 基因的拷贝数分别根据Ct值计算获得。取3次重复的平均值，用目的基因的拷贝数除以β-actin 的拷贝数作为靶基因的相对表达量。

1.3.7过表达载体的构建及细胞转染：细胞总RNA的提取及cDNA的反转录如前所述。利用含BmtⅠ和PstⅠ酶切位点的引物扩增大鼠DKK-1和BTBD10 cDNA，DKK-1正向引物为5′-GGCTAGCCTATGAGGGCGGGAACAAG-3′，反向引物为：5′-GCTGCAGCGAGCGAACTGGTGAGCAA-3′；BTBD10正向引物为：5′-GGCTAGCCCATCTCGTCCAAGCAGTCC-3′，反向引物为：5′-GCTGCAGCCGGCTCTTTCCTTCCTCCT-3′。双酶切DKK-1和BTBD10扩增产物插入pcDNA3.1载体中，获取 pcDNA3.1- DKK-1和pcDNA3.1- BTBD10重组表达质粒。使用FuGENE HD 转染试剂盒进行转染。采用Real-time PCR和Western blot检测稳定转染细胞DKK-1和BTBD10的表达。

1.3.8细胞增殖测定：采用MTT法检测细胞增殖。收集细胞，胰酶消化后计数，以6×104个/孔接种于96孔培养板，每孔加入10 μL MTT于37 ℃ 孵育4 h，加入100 μL的DMSO以溶解Formazan，置摇床震荡至Formazan充分溶解，用酶标仪测定560 nm处吸光度值。实验重复3次。

1.3.9细胞凋亡测定：采用流式细胞术检测细胞凋亡。收集细胞，在PBS中洗涤，采用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒，于FACS流式细胞仪中进行双色荧光细胞流式计数，计算凋亡细胞百分比。

1.4统计学处理采用SPSS19.0软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1脑出血模型评估 脑出血组大鼠平衡木行走得分高于对照组和假手术组(P<0.05)，而肌力测验评分显著低于对照组和假手术组(P<0.05)，假手术组与对照组间大鼠平衡木行走得分和肌力测验评分无统计学差异(表1)。

表 1　各组大鼠平衡木行走和肌力

注：与对照组和假手术组分别比较，aP<0.05

2.2细胞凋亡相关蛋白的表达 与对照组比较，脑出血组大鼠脑组织中Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)，促凋亡分子Bax表达增高(P<0.05)，p-Akt表达降低(P<0.05)，Akt总蛋白表达无统计学差异(P>0.05)，假手术组大鼠各基因表达量与对照组无统计学差异。与0 h比较，大鼠脑出血6、12、24、72、120 h后脑组织中Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)，而Bax表达则于脑出血后12、24、72、120 h升高(P<0.05)，p-Akt表达于脑出血6、12、24、72、120 h后下降(P<0.05)，而Akt总蛋白表达量未见统计学变化(P>0.05)。具体结果见图1～4。

与对照组比较，aP<0.05；与组内0 h点比较，bP<0.05。表2～6同

图1各组大鼠造模术后不同时间脑组织Bcl-2蛋白表达比较

图2各组大鼠造模术后不同时间脑组织Bax蛋白表达比较

图3各组大鼠造模术后不同时间脑组织p-Akt的蛋白比较

图4各组大鼠造模术后不同时间脑组织Akt蛋白比较

图5各组大鼠造模术后不同时间脑组织DKK-1 mRNA表达量

图6各组大鼠造模术后不同时间脑组织DKK-1蛋白表达量

2.3各组大鼠脑组织DKK-1及其mRNA表达与对照组比较，脑出血组大鼠脑组织中DKK-1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05)，假手术组大鼠与对照组大鼠比较差异无统计学意义；与0 h比较，大鼠脑出血12 h、24 h、72 h、120 h时间点脑组织DKK-1 mRNA和蛋白表达均升高(均P<0.05)。具体结果见图5～6。

2.4DKK-1转染上调DKK-1的表达 DKK-1转染组大鼠皮质神经元中DKK-1 mRNA和DKK-1蛋白表达水平均高于对照组和空载体组(P<0.05)，而对照组与空载体组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图7。

2.5DKK-1在体外促进大鼠皮质神经元凋亡 DKK-1转染组细胞凋亡率达(56±6)%，高于对照组和空载体组的(12±2)%和(13±3)%(P<0.05)；而对照组和空载体组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.6DKK-1通过抑制Akt磷酸化促进细胞凋亡DKK-1过表达组p-Akt表达水平低于对照组和空载体组(P<0.05)，而总Akt表达无统计学差异，对照组与空载体组间p-Akt和Akt表达均无统计学差异(图8A)。BTBD10过表达组中p-Akt和Bcl-2蛋白水平高于对照组及空载体组(P<0.05)，Bax蛋白表达水平则低于对照组和空载体组(P<0.05)；对照组、空载体组及BTBD10过表达组间总Akt和DKK-1蛋白表达比较均无统计学差异(图8B)。BTBD10过表达组神经元相对细胞存活率高于对照组和空载体组(P<0.05)，对照组与空载体组间则无统计学差异(图8C)；BTBD10和DKK-1共转染组大鼠神经元存活率高于DKK-1过表达组(P<0.05，图8D)。

与对照组和空载体组分别比较，aP<0.05

图7大鼠神经元中转染DKK-1过表达载体或空载体后细胞DKK-1 mRNA和蛋白表达比较

A、B：Western blot检测结果；C、D：MTT法检测结果；与对照组比较，aP<0.05

图8DKK-1或(和)BDBT10过表达后神经元蛋白表达及细胞存活率检测

3讨论

脑出血发生的原因主要与脑血管的病变有关，血液流入脑实质特别是脑室和蛛网膜下腔[6]时，导致脑实质正常解剖结构的破坏，局部压力增加，引起脑实质水肿，进而引发炎性反应、氧化应激等继发性损伤[7]。其中，神经元凋亡被认为是最关键的继发性损伤的病理变化之一，该过程依赖于复杂的促凋亡和抗凋亡信号的精细调节[8]。

DKK-1是一种分泌蛋白，被认为是一种促凋亡因子。研究结果显示，DKK-1能够促进神经退行性病变并参与应激诱导的神经元凋亡[4，9]。DKK-1通过抑制Wnt信号通路参与应激或病理因素引起的神经元凋亡。如长期雌激素缺乏可引起DKK-1表达上调，进而诱发海马神经元Wnt/-catenin信号通路失调[10]。Matrisciano等[9]研究发现DKK-1参与了应激诱导的脑海马损伤。本研究通过颅内注射自体外周血建立脑出血大鼠模型，分析大鼠脑组织相关基因表达发现，脑出血大鼠出血区域脑组织中的抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，而促凋亡蛋白Bax表达上升；与此同时，该区域中脑组织DKK-1 表达显著升高，提示DKK-1与神经元的凋亡有关。

丝氨酸/苏氨酸激酶Akt是位于生长因子、细胞因子和其他细胞刺激的下游细胞信号的控制中心[11]。作为一种关键的信号调节分子，Akt与细胞存活、细胞增殖及细胞生长密切相关[11-13]。研究结果显示，Wnt家族分子能够正向调节Akt信号通路。如在人骨肉瘤细胞中，Wnt5a 能够激活IP3/Akt信号通路，进而促进癌细胞的迁移[14]；在胰腺癌细胞中，Wnt5a能够活化Akt/NF-κB信号通路，从而抑制胰腺癌细胞凋亡[15]；在神经细胞中，Wnt1能够激活Akt1并发挥神经保护作用[16]。作为一种Wnt信号通路的拮抗抑制剂，DKK-1 在Akt信号通路中发挥负向调节的作用。如Weng等[17]研究显示，下调DKK-1的表达能够促进Akt的磷酸化，激活Akt信号通路，从而抑制骨细胞的凋亡。本研究发现，在大鼠神经元中，过表达DKK-1能够抑制Akt的磷酸化。作者推测：DKK-1可能通过抑制Wnt信号发挥负向调节Akt信号通路的作用。BTBD10是一种Akt磷酸化激激活剂，其作用原理是通过降低蛋白磷酸酶2A对Akt的去磷酸化及抑制作用[18]。为验证上述推测，本研究通过上调神经元中BTBD10水平，并探讨BTBD10与神经元存活率间的关系发现，上调神经元中BTBD10的表达可增强Akt磷酸化水平，但是对Akt总蛋白及DKK-1蛋白表达的影响则较小。进一步研究发现，BTBD10过表达显著提高神经元的存活率。采用BTBD10与DKK-1共转染处理，神经元的存活率显著高于DKK-1转染组，表明DKK-1抑制神经元存活与其抑制Akt的磷酸化有关，而对DKK-1的表达没有直接作用关系。进一步提示DKK-1诱导神经元凋亡是通过对Akt信号通路的抑制实现。

综上所述，本研究结果发现DKK-1在发生神经元凋亡的出血区域脑组织中高表达，提示DKK-1可能参与了神经元凋亡的过程。通过体外上调DKK-1在大鼠皮质神经元凋亡中的表达，证实了DKK-1具有促进神经元凋亡的作用，且DKK-1部分通过抑制Akt磷酸化促进神经元的凋亡。如何抑制脑出血后DKK-1的表达，从而减少脑出血造成的神经元凋亡尚需进一步研究。

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(本文编辑：时秋宽)

Effect and mechanism of DKK-1 in neuronal apoptosis in rat with hemorrhagic stroke

ZHANGFanxi*,ZHANGJianmin,HUANGXiaolong,ZHOUYufeng,CHENPeng.

*DepartmentofNeurosurgery, 324HospitalofthePeople’sLiberationArmy,Chongqing400020,ChinaCorresponding author: ZHANG Fanxi, Email:aienlifz@163.com

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the role and mechanism of Dickkopf-1 (DKK-1) in neuronal apoptosis of rat with intracerebral hemorrhage(ICH). MethodsAdult male SD rats(n=40) were randomly divided into the control group (n=13), the sham group (n=13) and the ICH group (n=14). The ICH rat model was established by intracerebral injection of peripheral blood. This model was assessed by beam-walking assay and muscle strength testing. Furthermore, expressions of Bcl-2, Bax, p-Akt, Akt and DKK-1 protein and the mRNA were analyzed by Real-time PCR and Western blot. Primary rat cortical neurons were divided into groups as follows: (1) the control,empty vector and DKK-1 overexpression group; (2)the control,empty vector and BTBD10 overexpression group. The expressions of DKK-1 and phosphorylated Akt were analyzed. The apoptosis was determined by flow cytometry. ResultsThe score of beam walking assay in the ICH group was significantly increased, and the muscle testing score was significantly lower than that in the control and sham groups (all P<0.05).Compared with the control and sham groups, the expressions of Bcl-2 and p-Akt in brain tissues of rats with cerebral hemorrhage decreased, whereas the expressions of Bax and DKK-1 increased after ICH treatment(all P<0.05). In primary rat cortical neurons, the apoptosis rate and p-Akt expression level in the DKK-1 overexpression group were significantly higher than those in the empty vector and control groups (P<0.05).Furthermore, the p-Akt level in the BTBD10 (an Akt phosphorylation activator) overexpression group was significantly higher than that of the empty vector and control groups (all P<0.05). Bcl-2 protein level in the BTBD10 overexpression group was significantly higher, while Bax protein expression was significantly lower than those in the empty vector and control groups (all P<0.05). Additionally, the neuronal survival rate in the BTBD10 overexpression group was significantly higher than that in the empty vector and control groups (all P<0.05) and the neuronal survival rate in the BTBD10 and DKK-1 co-transfected group was significantly higher than that in the DKK-1 transfected group (P<0.05). ConclusionsDKK-1 overexpression might promote neuronal apoptosis in rats with hemorrhagic stroke through the inhibition of Akt phosphorylation.

Key words:cerebral hemorrhage; DKK-1; apoptosis; Akt

doi：10.3969/j.issn.1006-2963.2016.01.005

基金项目：中国人民解放军神经创伤防治重点实验室2013年开放课题资助项目(NTP2013005)；国家科技惠民计划项目(2013GS500101-15)

通讯作者：张凡喜，Email：aienlifz@163.com

中图分类号：R743.3+4

文献标识码：A

文章编号：1006-2963 (2016)01-0019-06

(收稿日期：2015-02-04)