黄国全，孙建华，吴泉峰(湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院胃肠外科，湖北 恩施 445000)

三磷酸腺苷酶家族蛋白2过表达作为胃癌预后标志物可行性研究

黄国全，孙建华，吴泉峰
(湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院胃肠外科，湖北 恩施 445000)

目的 探讨三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATAD2)表达与胃癌患者疾病预后关系。方法 采用定量PCR方法检测15例新鲜胃癌组织和临近非肿瘤组织中ATAD2 mRNA表达情况，采用免疫组织化学方法检测166例胃癌组织石蜡包埋样本中ATAD2表达情况，分析ATAD2表达与166例胃癌患者疾病临床病理学特征的关系。结果 与临近非肿瘤组织比较，胃癌组织中ATAD2 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P< 0.001)。肿瘤临床分期、肿瘤侵袭深度、淋巴结转移及远处转移为影响胃癌组织ATAD2过表达的显著性因素。生存分析结果显示，ATAD2过表达是胃癌患者疾病预后不良的独立预后因素(P< 0.001)。结论 ATAD2过表达胃癌患者的总生存率低于低表达患者，ATAD2过表达可以作为胃癌患者疾病预后生物标志物。

三磷酸腺苷酶家族蛋白2；胃癌；预后；生物标志物

胃癌在肿瘤性疾病中发病率仅次于肺癌、乳腺癌和结肠直肠癌，死亡率仅次于肺癌[1]，中国的胃癌患者约占全球的33%[2～4]。研究表明，美国2015年胃癌新发病例24590例，胃癌死亡患者10720例[5]。大多数胃癌患者在确诊后均被诊断为局部或远处转移，且一半胃癌患者手术切除后会复发[6]。因此，临床上寻找一种与胃癌患者临床病理学特性相关的疾病预后标志物十分有必要。本研究检测胃癌组织中三磷酸腺苷酶家族蛋白2(ATPase family，AAA domain containing 2，ATAD2)mRNA和蛋白表达情况，分析其表达与胃癌患者临床病理学特征的关系，以评估ATAD2表达作为胃癌患者疾病预后生物标志物的可行性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2004～2008年在我院肿瘤科治疗的166例胃癌患者，男104例，女62例，术中采集胃癌及临近非肿瘤样本并浸于石蜡中。其中15例新鲜临床样本为医院新近接收的胃癌患者，术中采集临床样本并采用液氮浸泡后提取总RNA。166例胃癌患者术后随访8年，通过查阅病历获取患者一般资料见表1。所有患者均为首次发病，入组前均采用其它方法进行治疗。本研究通过我院伦理委员会审批，患者知情并同意。

1.2 定量PCR检测 采用TRIzoI试剂(Takara，日本)提取15例新鲜样本的总RNA，按照Prime ScriptTM逆转录试剂盒操作说明制备cDNA。通过SYBR Premix Ex TaqTM II(RR820，日本)测定样本中ATAD2基因拷贝数。引物序列及操作方法参考文献[7，8]。

1.3 免疫组织化学检测 采用免疫组织化学染色方法检测166例石蜡包埋胃癌样本中ATAD2蛋白表达情况，切片厚度为4 μm，采用二甲苯脱石蜡和脱水，采用过氧化氢来灭活内源性过氧化物酶活性，之后浸入10%浓度的脱脂奶中，37 ℃封闭30 min。切片放入小鼠抗人ATAD2单克隆抗体(1∶3000稀释，Abcam公司，美国)中，4 ℃冰箱孵育过夜，次日，采用PBST反复洗涤，放入亲和素标记的山羊抗小鼠IgG二抗中，反复洗涤，加入标记HRP的生物素，孵育20 min，完成上述步骤后加入DAB进行显色。

表1 ATAD2表达与胃癌患者临床病理学特征

1.4 评价标准 组织切片的ATAD2蛋白免疫组织化学染色结果由两位对患者临床资料不了解的病理学家进行评分：①按照染色强度分成0分(染色阴性)，1分(弱阳性)和2分(强阳性)。②根据阳性细胞计数结果分为0分(0～5%)，1分(5%～20%)，2分(21%～50%)和3分(>51%)。免疫组织化学染色最终结果由上述两部分结合而成[20]，总分0～6分，≥3分为高表达，<3分为低表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据处理。计数资料比较采用卡方检验；等级资料比较采用Wilcoxon检验；生存情况分析采用Kaplan-Meier曲线和单一与多重变量Cox线性回归分析。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织ATAD2 肿瘤细胞的胞质和胞核中均有ATAD2表达，其中胞核中表达强度显著高于胞质(图1)。mRNA与蛋白过表达情况 采用定量PCR方法检测15例胃癌肿瘤组织和临近非肿瘤组织ATAD2表达情况，结果表明胃癌组织中ATAD2表达水平显著高于临近非肿瘤组织(图2)。采用免疫组织化学方法检测166例胃癌石蜡包埋样本中ATAD2蛋白表达情况，结果显示肿瘤样本中有51.8%为ATAD2高表达，而在临近非肿瘤组织中仅有18.7%的样本为高表达，差异有统计学意义(χ2=7.19，P= 0.005)，见表2。

图1 免疫组织化学染色检测胃癌组织ATAD2表达 a：临近非肿瘤组织样本中阴线对照；b：临近非肿瘤组织样本中弱阳性样本；c：胃癌组织中阴性样本；d：胃癌组织中弱阳性样本；e：胃癌组织中中等表达样本；f：胃癌组织中强阳性样本

图2 定量PCR检测15例新鲜胃癌样本及临近非肿瘤组织

表2 166例胃癌样本与临近非肿瘤样本中ATAD2表达情况 [n(%)]

2.2 胃癌患者ATAD2过表达的临床意义 采用Kaplan-Meier曲线进行生存分析发现，166例胃癌患者中ATAD2过表达患者的总生存率低于低表达患者，差异有统计学意义(P<0.001)(图3)。调整临床分期、肿瘤侵袭深度、淋巴结转移和远处转移因素的多变量分析结果表明，ATAD2过表达是胃癌患者疾病预后的独立因素，见表3。

图3 ATAD2表达与胃癌患者疾病总生存期分析

表3 166例患者单一与多重变量Cox回归分析

3 讨论

ATAD2是AAA+ATPase家族成员[9]，包含两个ATPase相关细胞活性域，均为雌激素受体共激活剂[10]。ATAD2基因位于基因组8q24，该区域为癌症基因活跃区，ATAD2直接参与原癌基因的调节，例如ACTR、AIB1和SRC-3。已有研究表明ATAD2通过调节细胞分化、增殖、转移、凋亡和细胞周期，进而参与肿瘤发生[11，12]。近几年，多篇文献报道了ATAD2基因在不同种类组织中表达的临床意义，例如乳腺癌[13～16]、肝癌[11，17，18]、淋巴瘤[15，19]、子宫内膜癌[20，21]、卵巢癌[22]和肺癌[23]等。然而，ATAD2表达对胃癌患者疾病预后价值临床研究较少。

ATAD2蛋白空间结构预测结果表明，其含一个肩部域和ATPase域，其基因位于癌症基因活动频繁的染色体8q24区域[8]。ATAD2结果表明其主要参与遗传基因调节，包括细胞增生、分化和凋亡。在乳腺癌细胞中，ATAD2为雌激素作用靶点，且是雌激素介导的细胞增生和细胞周期发展所必须的[7]。有意思的是ATAD2也是雄激素依赖的前列腺癌细胞增殖和存活所必须的[24]。除采用雌激素和雌激素受体途径外，ATAD2也是连接E2F和MYC途径所的主要成分，通过增强MYC依赖的转录促进肿瘤的侵袭[8，14]。

早期Zou等采用基因芯片分析过乳腺癌细胞表达ACTR时，意外发现ATAD2基因表达升高[7]。此后，大量研究报道ATAD2在多种肿瘤细胞中过表达，例如乳腺癌[14]、宫颈癌[10]、神经胶质瘤[9]、肝细胞癌[11]和卵巢癌[20]。本研究结果与上述研究报道一致，与临近非肿瘤组织相比，胃癌组织中ATAD2表达显著升高。

尽管大量文献分析了ATAD2过表达与多种肿瘤患者临床病理学特征的关系，而较少见到关于其在胃癌中的报道。为检测ATAD2蛋白在胃癌患者中表达的意义，本研究采用免疫组织化学染色方法检测了166例胃癌样本中ATAD2表达情况，并探讨其表达与胃癌患者临床病理学特征的关系。结果提示ATAD2蛋白过表达与临床分期、肿瘤侵袭深度、淋巴结转移及远处转移呈正相关关系。这一结果与Zhang等在肺癌的研究结果一致，此外，其研究结果还提示ATAD2过表达还与肺癌患者肿瘤分化、肿瘤大小有关[19]。Wan等检测ATAD2在110例卵巢癌中表达情况，结果证实其表达与患者肿瘤分期，网膜转移、腹水及CA125等密切相关[20]。此外，通过基因敲除卵巢癌细胞系ATAD2基因，结果表明其生长显著抑制[20]。

本研究结果提示，胃癌患者ATAD2过表达时其基本总生存期预后不良，多重变量分析结果表明，ATAD2过表达是胃癌患者疾病预后不良的独立因素。这一结果与Fellenberg等报道一致，其研究证实ATAD2过表达的骨肉瘤患者疾病总生存期显著短于低表达患者[25]。此外，Kalashnikova等检测185例乳腺癌样本中ATAD2表达情况发现，ATAD2过表达与肿瘤分期相关，且过表达患者疾病临床预后不良[14]。

总之，本研究结果证实胃癌组织中ATAD2 mRNA和蛋白过表达，且与患者临床分期、肿瘤侵袭深度、淋巴结转移和远处转移有关，且ATAD2过表达是胃癌患者疾病预后的独立因素。

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ATAD2 over-expression is an independent poor prognostic biomarker for patients with gastric cancer

HUANGGuo-quan，SUNJian-hua，WUQuan-feng
(DepartmentofGastrointestinalSurgery，CentralHospitalofEnshiTujia-MiaoAutonomousPrefecture，Enshi445000，China)

Objective To investigate the prognostic value of expression of ATPase family AAA domain containing 2 (ATAD2) in patients with gastric cancer.Methods qRT-PCR was used to quantitatively detect the ATAD2 mRNA expression in 166 samples of fresh cancer and para-carcinoma tissues. Immunohistochemistry was used to examine ATAD2 protein expression in 166 paraffin-embedding samples. The relationship between clinicopathological features and ATAD2 expression was analyzed.Results The expression of ATAD2 mRNA and protein in gastric cancer samples were significantly higher than that in normal tissues (P< 0.001). ATAD2 over-expression was highly correlated with cancer clinical stage，tumor depth，lymph node metastasis and distant metastasis. According to our survival analysis，ATAD2 protein over-expression was a poor independent prognostic factor for patients with gastric cancer (P< 0.001).Conclusion ATAD2 could be used as a prognostic biomarker for patients with gastric cancer.

Gastric cancer，Prognosis；ATAD2；Biomarker

孙建华

R735.2

A

1672-6170(2016)06-0029-05

2016-01-09；

2016-06-24)