王锦秀，黎 涛，赵 平(四川省广元市中心医院消化内科，四川 广元 628017)

基于木犀草素联合阿霉素治疗肝癌基础研究

王锦秀，黎 涛，赵 平
(四川省广元市中心医院消化内科，四川 广元 628017)

目的 制备载木犀草素及阿霉素双药胶束，评价该胶束并考察体内外治疗原发性肝癌疗效。方法 溶剂挥发法制备载木犀草素及阿霉素的双药胶束，采用马尔文粒径仪测粒径，评价载双药胶束体外释放情况；考察其体外抗原发性肝癌活性，并建立原发性肝癌昆明鼠皮下模型，考察该载药胶束体内治疗原发性肝癌疗效。结果 载双药胶束平均粒径(112.5±2.3)nm(n=3)，多分散指数(PDI)(0.152±0.014)，对两种抗癌药物包封率均>80%。载双药胶束对人肝癌细胞HepG2细胞的细胞毒性显著大于两种抗癌裸药(n=5，均P< 0.05)，细胞对药物摄取率也明显高于裸药。体内实验提示载双药胶束能抑制肿瘤增殖，相对裸药组，能显著提高荷瘤小鼠存活时间(χ2=4.874，P< 0.05)。结论 载双药胶束粒径小，对木犀草素及阿霉素的包封率高，相对于裸药，载药胶束能提高药物细胞摄取，且能增强细胞毒性作用。该载药胶束可以作为一种治疗原发性肝癌新的载药体系。

木犀草素；阿霉素；胶束；原发性肝癌

原发性肝癌(primary liver cancer，PLA) 是一种恶性程度高、进展快、预后差的恶性肿瘤，全世界发病率和死亡率分别列所有肿瘤的第7位和第4位[1]。原发性肝癌早期症状并不明显，发现时已多处于晚期，而晚期患者多因癌细胞扩散和转移导致化疗、放疗疗效均较差。所以，研发新的载药体系，提高原发性肝癌治疗疗效势在必行。木犀草素是一种从天然中草药中提取的多酚类化合物[2]，广泛存在于金银花、白毛夏枯草等药物中[3]。其作用于肿瘤细胞的线粒体[4]，对多种肿瘤细胞增殖都有一定程度抑制作用，特别是对原发性肝癌有明显抑制效果[5，6]。但由于木犀草素属于黄酮类化合物，溶解性差，限制了其抗肿瘤疗效[7]。阿霉素是临床上常用广谱抗肿瘤药物，进入肿瘤细胞后嵌入DNA，抑制DNA合成，进而抑制肿瘤细胞增殖[8]。本实验选用聚合物F127制备纳米胶束包载木犀草素和阿霉素，评价该胶束并考察其体内外治疗原发性肝癌疗效。

1 材料与方法

1.1 材料 木犀草素购自西安昊轩生物有限公司；阿霉素购自大连美仑生物技术有限公司；制备胶束的高分子F127购自四川铂克科技有限公司；HepG2、H22肝癌细胞株购买于中国科学院上海细胞实验室；所有免疫组化试剂盒购自凯基生物；实验用化学试剂购自成都科龙化工有限公司。

1.2 胶束的制备 本胶束制备采用溶剂挥发法[9]。操作如下：称取聚合物F127、脱盐酸化阿霉素和木犀草素溶解于四氢呋喃，注射器匀速缓慢滴加至适量中速搅拌的蒸馏水中。然后放置于通风橱中搅拌至四氢呋喃全部挥发，透析除掉没有包载的药物，冻干得到载双药胶束。

1.3 胶束粒径、临界胶束浓度、包封率和载药率测定 用马尔文粒径仪测得载双药胶束平均粒径，临界胶束浓度(critical micelle concentration，CMC)采用芘荧光探针法。称取20 mg载药冻干粉末，二甲基亚砜(DMSO)溶解后用高效液相色谱测该胶束成份。通过标准曲线得到木犀草素和阿霉素两种药物浓度，进而根据下列公式计算出胶束载药量和载药效率：

1.4 体外释放实验该载药胶束释放实验 分别模拟了胶束在血液循环和细胞中释放环境，透析介质为磷酸盐缓冲液体系PBS(pH=7.4)和醋酸盐缓冲液体系ABS(pH=5.0)。量取1 ml载双药胶束水溶液加入截留分子量为5000透析袋中，用棉线系好两头后，放入50 ml离心管。加入30 ml透析液，将离心管置于37 ℃恒温摇床中震摇。分别于30 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h及36 h取出1 ml透析液，然后再补加入1 ml新的透析液继续在摇床上震摇。将取出的透析液用0.22 μm微孔过滤器过滤，用高效液相色谱检测，记录峰面积，并根据标准曲线计算得到木犀草素和阿霉素浓度。然后计算不同时间点双药胶束累积释放百分率，根据结果绘制出两种药物在不同缓冲液体系下体外释放曲线。

1.5 细胞毒性实验 取对数期生长的HePG2细胞，胰酶消化后用10%FBS的DMEM高糖培养基稀释细胞，显微镜下观察细胞密度为1×105个/毫升，吹打均匀后加入96孔板，置37 ℃培养箱孵育24 h。将木犀草素、阿霉素与载双药胶束分别以无血清培养基稀释，其中木犀草素需要加入DMSO促溶，每孔加100 μl，每个浓度6个平行孔。将96孔板置于二氧化碳培养箱中孵育24 h后每孔加入10 μl MTT溶液，继续孵育4 h。吸干孔内液体后，每孔加入100 μl DMSO，于摇床上振荡10 min以溶解蓝紫色结晶物。在570 nm波长下，用酶标仪测定吸光度(A)，计算细胞存活率。细胞存活率计算公式如下[10～12]：细胞存活率=A样品/A对照×100%。A样品为木犀草素，阿霉素以及载双药胶束混合培养细胞后所测得的吸光度值。A对照为空白培养液培养细胞后测得的吸光度值。

1.6 细胞对胶束的摄取 取对数生长期HepG2细胞接种于24孔板，将裸药阿霉素和载双药胶束用无血清培养基稀释到10 μg/ml，继续培养4 h。孵育结束后，移液器吸去培养基，加入PBS终止细胞摄取，并用PBS冲洗三遍，乙醇4 ℃固定30 min，加5 μg/ml DAPI，继续孵育10 min，PBS冲洗，最后荧光显微镜下观察细胞对药物摄取情况。继续孵育10 min，PBS冲洗，最后荧光显微镜下观察细胞对药物摄取情况。

1.7 小鼠肿瘤模型的建立 24只体重25 g左右雌性昆明小鼠分别在左前腋皮下注射100 μl无血清培养液含2×106个小鼠肝癌细胞H22细胞。接种后每天观察肿瘤生长情况，10天后小鼠左前腋皮下肿瘤可见且体积约为50 mm3(利用游标卡尺测量肿瘤的长径a和短径b，按照肿瘤体重公式V=ab2/2进行计算)。建模成功的昆明鼠随机分为载双药胶束组、裸药阿霉素组、裸药木犀草素组及空白组，每组6只。

1.8 小鼠体内抗肿瘤治疗 建模成功后第0、3、6、9天，通过尾静脉注射给药物治疗，4组样品分别为载双药胶束组、裸药阿霉素组、裸药木犀草素组和空白盐水组。根据小鼠体重计算每组注射剂量(阿霉素3 mg/kg，木犀草素3 mg/kg)。第一次尾静脉给药之后每隔2天测量老鼠肿瘤体积。

1.9 组织标本的处理和检测 药物治疗结束后第12天取出肿瘤组织，石蜡包埋切片后行HE和TUNEL染色。

1.10 统计学方法 采用SPSS 18.0 软件进行分析。计量资料用均数(标准差描述，计量资料用频数和百分数描述，计量资料组间比较采用t检验或非参数检验。计数资料采用卡方检验。用Kaplan-Meier法估计组间的累积生存率，并用Log-rank检验进行比较。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶束粒径、临界胶束浓度、包封率和载药率测定及体外释放实验 胶束粒径为(112.5±2.3) nm(n=3)，多分散指数(PDI)为(0.152±0.014)，表明该胶束粒径分散均匀。该胶束CMC为0.72 mg/L(见图1a)，其中木犀草素包封率(n=3)和载药率(n=3)分别为(73.45±3.4)%、(5.61±0.23)%，阿霉素包封率(n=3)和载药率(n=3)分别为(83.12±2.6)%、(6.89±00.18)%(见图1b)。

图1 载双药胶束的评价 A：粒径分布；B：药物释放曲线

2.2 细胞毒性实验 载双药胶束对HepG2细胞的增殖抑制作用明显高于单用木犀草素(t=4.939，P< 0.01)以及单用阿霉素(n=5，t=2.429，P< 0.05)见图2。

图2 木犀草素、阿霉素以及载双药胶束对HepG2细胞的细胞毒性作用(n=5)

2.3 细胞对胶束的摄取 细胞核被DAPI染成了蓝色荧光，A为裸药阿霉素摄取情况，而B为载双药胶束摄取情况见图3。从图中可以看出，A的红色荧光和B的红色荧光无显著差异，证明该载双药物胶束可以将药物递送到细胞内。

2.4 载双药胶束的体内抗肿瘤组织病理切片 从图4中可以看出，空白组细胞形态完整，无细胞空泡，细胞形态完整，未出现凋亡现象。阿霉素组和木犀草素组则部分细胞出现空泡和细胞轮廓不完整。载双药胶束组则大量细胞出现空泡细胞轮廓不完整，细胞核也有大量破碎。从图4中可以看出，载双药胶束组凋亡细胞最多，阿霉素组次之，木犀草素组则比阿霉素组细胞凋亡的更少，生理盐水组几乎没有细胞凋亡。

图3 阿霉素和载药胶束细胞摄取 A：为裸药阿霉素组，B：为载双药胶束组，从左到右依次是DAPI染细胞核的荧光，阿霉素荧光，合图为阿霉素和DAPI荧光的叠加，明场为光镜下细胞的形态图(比例尺=100 μm)

图4 小鼠原发性肝癌皮下肿瘤模型治疗后病理切片 a：HE染色，b：Tunel染色

2.5 小鼠体内抗肿瘤效果 药物治疗结束后第21天，胶束组、裸药阿霉素组、裸药木犀草素组及空白组老鼠除处死做病理切片检查外均未出现死亡，第21天的肿瘤平均体积分别为：(105.5±52.3)mm3、(475.4±73.2)mm3、(825.6±68.3)mm3及(1650±122)mm3，裸药阿霉素和裸药木犀草素组肿瘤平均体积均高于载双药胶束组(t=9.194，t=18.718，均P< 0.01)。空白组老鼠在第30天开始即出现死亡，至第38天老鼠完全死亡；裸药阿霉素和裸药木犀草素组则分别从第40天和第34天开始出现死亡，至饲养周期结束(第50天)，2组老鼠也全部死亡；而胶束组除一只非正常死亡外，其余老鼠均未死亡。生存曲线如图5所示。采用Log Rank对各组生存曲线分布进行分析，结果表明，载双药胶束组相比于阿霉素组和木犀草素组，小鼠生存率差异有统计学意义(χ2=4.874，χ2=4.874，均P< 0.05)。而木犀草素组和阿霉素组相比，小鼠生存率差异无统计学意义(χ2=2.046，P> 0.05)。

图5 各组小鼠生存曲线图

3 讨论

木犀草素作为一种植物中提取的抗癌药物，其良好抗癌活性可以用于原发性肝癌治疗。针对木犀草素溶解性差和口服难以起效等缺点，我们采用胶束包载木犀草素治疗原发性肝癌，能解决木犀草素治疗肿瘤的缺点。同时，针对木犀草素治疗靶点为细胞的线粒体，本实验包载了广谱细胞核靶向的肿瘤化疗药物阿霉素，联合两种不同作用机理抗癌药物，可以有效协同治疗原发性肝癌。

目前临床有多种治疗原发性肝癌药物，但经常发生肿瘤细胞耐药，而本实验设计了联合包载阿霉素和木犀草素胶束治疗原发性肝癌，则能有效避免肿瘤细胞耐药，为原发性肝癌抗耐药治疗提供了新思路[13～15]。本实验针对目前抗癌药物在水中难溶解以及体内抗肿瘤活性不高的缺点，采用纳米胶束包载抗癌药物，很好的解决了药物溶解性问题。同时，利用纳米胶束的尺寸优势，以及肿瘤血管高通透性和滞留效应，让抗癌药物更好的富集于肿瘤组织，增强药物的抗肿瘤效果。本实验以美国食品药品监督管理局批准的药用高分子F127作为包载两种抗癌药物的高分子材料，该材料对难溶性药物木犀草素有很好增溶作用，可以增强木犀草素细胞毒性作用，细胞试验中，载双药胶束组比单用木犀草素和单用阿霉素有更好的细胞毒性作用就很好证明了这一点。同时，胶束包载抗癌药物也能提高肿瘤细胞对药物摄取，在包载木犀草素同时载入了阿霉素，两种药物作用于不同的亚细胞器，对细胞增殖抑制作用能有效叠加，能更好增加药物治疗肝癌的活性，在之后的体内动物实验以及对不同组小鼠的肿瘤切片的病理检测中，也能很好证明这一理论。另外，由于纳米药物载体特殊性还可以使抗肿瘤药物具有一定被动肿瘤靶向作用，最终可以提高原发性肝癌治疗疗效。

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A basic study of combination of doxorubicin with luteolin for treatment of hepatocellular carcinoma

WANGJing-Xiu，LITao，ZHAOPing
(DepartmentofGastroenterology，GuangyuanPeople’sHospital，Guangyuan628017，China)

Objective In this study，we prepared micelles which loaded dual drugs luteolin and doxorubicin (DOX) to evaluate its anti-primary liver cancer activity and the pharmaceutical properties in vitro and in vivo.Methods The conventional solvent evaporation method was used to prepare the dual drug loaded micelles. The particle size of micelles was characterized by a laser granulometry. The release behavior in vitro of drug loaded micelles was evaluated by dialysis. The cell toxicity and the cellular uptake assays were employed to evaluate the anti-tumor activity. In addition，the dual drugs loaded micelles were used for in vivo pharmacology and anti-tumor evaluation.Results The dual drug loaded micelles showed uniform morphology with sizes (112.5±2.3)nm(n= 3). The dispersion index (PDI) was(0.152±0.014)and the encapsulation efficiency of the two anti-cancer drugs were both more than 80%. In vitro cytotoxicity experimental results revealed a low cytotoxicity of BSPs from micelles on human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 (P< 0.05，n= 5). The cellular uptake rate was improved. In vivo，the inhibitory effect on tumor-bearing mice was observed. The dual drug loaded micelles could significantly improve the survival rate of the mice(χ2=4.874，P< 0.05).Conclusion The micelles possess small size and high entrapment efficiency. The dual loaded micelles improve the cellular drug uptake and enhance the cytotoxicity to the tumor cells. Meanwhile，the special features of the nano-particles of dual drug loaded micelles have passive targeting effect which can provide a promising drug delivery system for primary liver cancer therapy.

Luteolin；DOX；Micelles；Primary liver cancer

四川省科技厅科技支撑计划(编号：2011FZ0036)

R944

A

1672-6170(2016)06-0025-04

2016-03-14；

2016-08-30)