汪霄浙江省人民医院肿瘤内科，浙江杭州　310024



康莱特对晚期乳腺癌患者血清miRNA- 21的影响研究

汪霄
浙江省人民医院肿瘤内科，浙江杭州310024

[摘要]目的明确康莱特注射液对晚期乳腺癌患者血清miRNA-21水平的影响，为康莱特注射液在晚期乳腺癌患者中的疗效提供更充分的证据。方法2014年7月～2015年7月期间，收集82例晚期乳腺癌患者的详细资料及血清样本。患者应用浙江康莱特药业有限公司提供的康莱特注射液200 mL静滴，1次/d，治疗21 d。收集患者治疗后的血清样本。比较治疗前后患者KPS评分、体重以及血清中miRNA-21检测值的变化。结果在82例晚期乳腺癌患者中，65.9% KPS评分提高，58.5%体重增加，康莱特注射液治疗后患者血清中miRNA-21（2.02±0.12）表达明显低于治疗前（3.64±0.31）（P＜0.05）。结论康莱特注射液明显降低晚期乳腺癌患者血清miRNA-21的水平，为康莱特注射液在晚期乳腺癌患者中的疗效提供客观的证据。

[关键词]乳腺癌；康莱特；miRNA-21；晚期

乳腺癌是全世界范围内女性常见的恶性肿瘤之一，美国癌症协会报道，美国每年有12万乳腺癌新发病例，发病率约为72.2/10万。我国虽然属于乳腺癌的低发病率国家，但近年来乳腺癌的发病率明显增高，年增长率达到2%，在城市，乳腺癌已成为女性最常见的恶性肿瘤[1]。晚期乳腺癌患者往往由于一般情况差、卡氏评分低、恶病质等原因不能耐受化放疗，仅以姑息治疗为主。如何有效改善晚期乳腺癌患者的生活质量、延长生存期已成为晚期乳腺癌治疗中的重要部分。康莱特的有效抗癌成分是从中药薏苡仁中提取，从而制成中药注射剂。近年来，国内有相关文献报道康莱特注射液可以改善晚期恶性肿瘤患者的生活质量[2]。但研究结果缺乏客观的指标支持，无法从客观的生物分子水平论证其有效性。本研究通过对晚期乳腺癌患者使用康莱特注射液前后对血清中miRNA-21值进行比较，明确康莱特注射液对晚期乳腺癌患者的作用，为康莱特注射液在晚期乳腺癌患者中的疗效提供更充分的依据，现报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2014年7月～2015年7月我院诊治的82例患者，均为女性，年龄40～69岁，平均52.6岁。经过手术病理或穿刺病理确诊为乳腺癌，肿瘤分期为Ⅳ期，无法耐受放化疗；治疗前Karnofsky评分均≥40分，且停止其他治疗已1个月以上。

1.2研究方法

收集82例晚期乳腺癌患者的详细资料及血清样本。患者应用浙江康莱特药业有限公司提供的康莱特注射液200 mL静滴，1次/d，治疗21 d。收集患者治疗后的血清样本。康莱特治疗前后对患者进行Karnofsky评分，治疗前后测量患者体重，康莱特治疗过程中观察不良反应。比较康莱特治疗前后血清miRNA-21值。

1.3mi RNA-21测定

血清分装后储存于-80℃。对收集血清样本进行RNA提取。在进行血清miRNA-21定量前，首先需要选择一种合适的内参。由于目前尚无公认可用于miRNA相对定量的内参，因此，我们采用加入外源miRNA-cel-miRNA-39作为内参的方法，此miRNA不在人类表达。用Taqman miRNA逆转录试剂盒和miRNA特异性颈环结构进行反转录。将相关试剂于冰上解冻；以提取的小RNA为模版进行逆转录反应；待反应结束后，产物保存在4℃，准备进行q PCR分析。

荧光定量PCR检测miRNA-21。计算每种反应组分的用量，每个指标做3管重复：选用的Taq ManRMicroRNA Human Assays为：hsa-miR-21，目标序列：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT -GGATATTCGCACTGGATACGCTCAAC；创建相对定量的反应板文件。

1.4观察指标

观察Karnofsky评分、体重值、不良反应情况及miRNA-21值。

1.5评价标准

1.5.1Karnofsky（KPS）评分康莱特治疗前后，对患者进行Karnofsky（KPS）评分，如果治疗后比治疗前评分增加20分以上，为显著改善；如果治疗后比治疗前评分增加10～20分，为改善；评分没有增加，为稳定；评分减少10分以上，为减退。

1.5.2体重康莱特治疗后与治疗前相比，体重增加2.5 kg以上，为体重增加；治疗后与治疗前相比，减少2.5 kg以上，为体重下降；如果增加或减少都没有超过2.5 kg，为稳定。

1.5.3不良反应按WHO药物毒性分级标准评价不良反应。

1.6统计学方法

本研究采用2-ΔΔCt法分析样本miRNA-21的表达量。采用SPSS17.0统计学软件进行分析，样本miRNA-21的表达水平以（±s）表示，采取独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1治疗前后Karnofsky（KPS）评分比较

康莱特治疗前，患者的KPS评分主要处于40～59分的区间内，平均分值为47.2分。而康莱特治疗后，患者的KPS评分的平均分值上升到60.9分，整整提高13.7分，而治疗后评分主要处于50～69分的区间内。其中，改善31例，显著改善23例，稳定26例，减退2例。使用康莱特后，KPS评分得到提高患者共有54例，占总人数的65.9%。见表1。

表1　康莱特治疗前后患者KPS评分比较（n）

2.2体重值

患者在康莱特治疗前的平均体重值为53.1 kg，康莱特治疗后的平均体重值为57.5 kg。其中，体重增加48例（58.5%），体重稳定28例（34.1%），体重下降6例（7.3%）。康莱特注射液能够改善患者食欲及一般情况，使患者体重增加。

2.3不良反应

按WHO药物毒性分级标准评价，研究中所有患者均没有心电图、肝功能、肾功能的改变，也没有发现任何过敏反应。只有1例患者发现轻度静脉炎，对症处理后好转。

2.4康莱特注射液治疗前后患者血清中miRNA-21变化

康莱特注射液治疗后患者血清中miRNA-21 （2.02±0.12）表达明显低于治疗前（3.64±0.31）（t=2.19，P=0.027）。

3　讨论

临床研究表明，康莱特注射液是一种安全有效的广谱抗癌新药，而且能提供机体的免疫力，不良反应小，疗效显著[3]。但其抗肿瘤的机制仍亟待深入、系统的研究。

微小RNA（microRNA/miRNA）是一类内源性、非编码的单链小分子RNA[4]。近年来，高通量芯片检测技术以及高灵敏度实时反转录PCR（real-time RTPCR）技术得到了广泛的应用，研究者们发现miRNA的高低水平和许多肿瘤的发生发展及预后存在密切的关系，在一些研究中，发现miRNA同时也发挥了重要的调控作用。失调的miRNA作为癌症诊断、预后及治疗相关的标记物的作用越来越受到重视。

有学者[5]通过一种叫微阵列的芯片，于2005年第一次从乳腺癌组织及细胞株中筛选出miRNA谱，其中发现在这些异常表达的miRNA谱中，29条miRNA表现为表达失调，在表达失调的miRNA中，有12条的表达下调，具体来说，miRNA-125b、miRNA-145、miRNA-21以及miRNA-155这4种miRNA的变化最为明显。相关研究还发现，有一些miRNAs的表达失调和乳腺癌的相关分子病理特征及类型明显相关，其中包括ER、PR受体情况、肿块体积、脉管是否侵犯、Ki67等；除此之外，通过其中15条miRNAs的表达情况，我们完全可以把正常的细胞组织和相关癌组织明确区分开。Mattie等[6]使用相同的方法检测20个乳腺癌活检标本的miRNA表达谱，研究发现，通过miRNA表达谱，能够把HER-2及激素受体情况不同的分子分型的乳腺癌区分开。而我们都知道，分子分型不同的乳腺癌，它们具有完全不同的预后和治疗手段，各种治疗的组合情况也大不相同。近年来，有进一步的研究[7]证明；miRNA表达谱可以区分乳腺癌的五种分子亚型，而我们知道，各种乳腺癌的分子亚型与其预后及对不同治疗方案的反应都是密切相关，证明通过miRNA表达谱可以帮助我们进行临床决策。通过研究，Tavazoie等[8]筛选出多个乳腺癌MDA-MB-231衍生细胞株，这些细胞株具有较强的远处转移特性。同时，研究者也观察到，乳腺癌的远处转移与miRNA的异常表达也是有紧密关系的，其中有两种miRNA在抑制肿瘤远处转移中发挥非常重要的作用；如果乳腺癌患者中的这两种miRNA表达缺失或较低，其发生转移的可能性大，生存率也较别的乳腺癌患者要低得多。综上所述，miRNA具有重要的价值，不管是对乳腺癌患者的预后判断，还是在乳腺癌患者的治疗选择中，均起非常重要的作用。

文献表明，在结肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等多种肿瘤中，miRNA-21的表达存在上调[9]，这也表明miRNA-21对肿瘤的作用具有普遍性。而目前有很多的相关研究已经证明，miRNA-21作为一个癌基因[10]，它在多种实体肿瘤中，都有着非常重要的价值。在乳腺癌的细胞系、组织以及血清中，miRNA-21的表达上调，并且它还和乳腺癌的临床分期以及相关预后有密切的关系，可作为乳腺癌治疗效果的观察指标[11]。

近年来人们发现血清中可以检测出miRNA，且表达稳定，相比较肿瘤组织中miRNA检测技术复杂、创伤大的问题，外周血血清较容易取得和检测，应用方便。在血清中，miRNA能够较长时间的稳定存在，并且，它也能耐RNA酶的降解，在各种环境（包括将其煮沸、反复冻融、酸碱侵蚀等）下都不会有损失[12]。康莱特是双相广谱的抗肿瘤药物之一，它没有细胞毒性，以往的研究认为，康莱特可以让肿瘤细胞停滞于G2-M期，并诱导细胞凋亡[13]。也有文献提出，康莱特注射液可以显著改善恶性肿瘤患者的食欲，并提高患者的KPS评分[14]。国内有文献报道，康莱特注射液能抑制下游cyclin D1、cyclin E表达，并阻止肿瘤细胞进入S期，这是其增殖抑制的相关机制[15]。有相关研究指出，康莱特注射液能够抑制人乳腺癌MCF-7细胞的增殖，并且阻滞其细胞周期，从而使癌细胞出现凋亡，其相关机制可能是降低Bcl－2蛋白的表达以及增加Bax蛋白的活性[16]。在临床工作中，康莱特联合新辅助化疗可以减轻局部晚期乳腺癌患者骨髓抑制，提高免疫功能和化疗耐受性[17]。同时，也可以提高这类患者的化疗有效率，相关机制也许是下调ki-67、Survivin的表达[18]。目前，国内尚未有关于康莱特注射液对血清miRNA-21水平影响方面的研究。通过本研究明确康莱特注射液对晚期乳腺癌患者血清miRNA-21的影响，使miRNA-21明显下降，为康莱特注射液在晚期乳腺癌患者中的疗效提供更充分的依据。

本研究结束后，我们将进一步探讨miRNA-21在乳腺癌中通过作用于哪些靶基因发生作用，为进一步阐明乳腺癌发病机制奠定作用，为寻找新的潜在的分子治疗靶点提供依据。

[参考文献]

[1]吕大鹏，徐光炜．乳腺癌普查的国内外进展[J]．中国实用外科杂志，2006，26（1）：68-70．

[2]魏卫，管峦，吴海江，等．康莱特注射液治疗改善晚期恶性肿瘤患者生活质量的临床观察[J]．中国实用医刊，2012，39（8）：61-62．

[3]王云杰，黄立军，张志培．康莱特注射液治疗原发性肺癌的临床观察[J]．现代肿瘤医学，2006，14（1）：36-37．

[4] Ambros V．MicroRNA pathways in flies and worms：Growth，death，fat，stress，and timing[J]．Cell，2003，113（6）：673-676．

[5] Zhao Y，Samal E，Srivastava D．Serum response factor regulates a muscle -specific microRNA that targets Hand2 during cardiogenesis[J]．Nature，2005，436：214-220．

[6] Mattie MD，Benz CC，Bowers J，et al．Optimized highthroughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies[J]．Mol Cancer，2006，5：24．

[7] Blenkiron C，Goldstein LD，Thorne NP，et al．MicroRNA expression profiling of human breast cancer identifies new markers of tumor subtype[J]．Genome Biol，2007，8：R214．

[8] Tavazoie SF，Alarcon C，Oskarsson T，et al．Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis[J]．Nature，2008，451：147-152．

[9] Volinia S，Calin GA，Liu CG，et al．A microRNA expression signature of human solid tumors defines cancer gene targets[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2006，103：2257-2261．

[10] Krichevsky AM，Gabriely G．MiR-21：A small multifaceted RNA[J]．Cell Mol Med，2009，13（1）：39-53．

[11] Sota Asaga，Christine Kuo，Tung Nguyen，et al．Direct serum assay for microRNA -21 concentrations in early and advanced breast cance[J]．Clinical Chemistry，2011， 57（2）：184-191．

[12] Chen X，Ba Y，Ma L，et al．Characterization of microRNAs in serum a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases[J]．Cell Res，2008，18：997-1006．

[13] Jiang XL，Zhang L，Xu ZY，et al．KLT emulsion influenceon angiogenesis[J]．Tumor，2000，20（4）：313-314．

[14]甘霖霖，于镜泊，张海青，等．康莱特注射液在乳腺癌新辅助化疗中的作用[J]．肿瘤，2009，9（3）：283-285.

[15]梁铁军．康莱特抑制肝癌细胞Hep G2增殖的实验研究[J]．中国肿瘤临床，2006，33（13）：743-746．

[16]陈军，马岩，李榆，等．康莱特注射液对人乳腺癌MCF-7细胞增殖和凋亡的影响[J]．中国中医药信息杂志，2014，21（11）：48-51．

[17]谢小红，顾锡冬，赵虹．康莱特对局部晚期乳腺癌新辅助化疗耐受性的影响[J]．中国肿瘤，2014，23（4）：349-251．

[18]谢小红，顾锡冬，赵虹．康莱特联合新辅助化疗对局部晚期乳腺癌的临床研究[J]．浙江中医杂志，2014，49（2）：95-97．

Study on the effect of kanglaite injection on serum miRNA-21 in patients with advanced breast cancer

WANG Xiao
Oncology Department, Zhejiang Provincial People's Hospital, Hangzhou 310024, China

[Abstract]Objective To make clear the effect of kanglaite injetion on patients with advanced breast cancer serum miRNA-21 levels, providing more sufficient evidence for the effort of Kanglaite Injetion in patients with advanced breast cancer. Methods From July 2014 to July 2015, 82 cases of advanced breast cancer with detailed information and serum samples were collected. Kanglaite injetion was from Zhejiang Kanglaite Pharmaceutical Co. Ltd and were provided 200 mL intravenous drip,1 time/day, 21 days of treatment. Serum samples were collected from patients after treatments. For KPS score, weight and values of miRNA-21 detecion in the serum of patients before and after the change, the effect of Kanglaite injetion in the treatment of patients with advanced breast cancer were investigated. Results In 82 patients with advanced breast cancer, the 65.9% KPS score increased, and the 58.5% body weight increased, of Kanglaite injetion in the treatment of patients with serum of miRNA-21(2.02±0.12) expression was significantly lower than that before treatment(3.64±0.31)(P＜0.05). Conclusion The level of miRNA-21 in serum of patients with advanced breast cancer is decreased significantly by Kanglaite injetion, providing objective evidence for effort of Kanglaite injetion in patients with advanced breast cancer.

[Key words]Breast cancer; Kanglaite; miRNA-21; Advanced

[中图分类号]R737.9

[文献标识码]B

[文章编号]1673-9701（2016）03-0070-03

[基金项目]浙江省医药卫生科技项目一般研究项目（2015 KYB032）

收稿日期：（2015-11-11）