张文渊　丁盛娣　黄筱纮　沈俊俊浙江省湖州市中心医院妇产科，浙江湖州　313000



明胶酶A及其抑制剂TIMP-1在宫颈癌中的表达及其临床意义

张文渊丁盛娣黄筱纮沈俊俊
浙江省湖州市中心医院妇产科，浙江湖州313000

[摘要]目的研究明胶酶A及其抑制剂（TIMP-1）在子宫颈癌中的表达及与预后的关系。方法采用免疫组织化学（S-P）法检测47例子宫颈癌组织标本，31例CIN组织标本，31例正常宫颈组织标本中明胶酶A及其抑制剂（TIMP-1）的阳性表达。结果明胶酶A、TIMP-1在宫颈癌组织中的阳性表达率分别为80.85%、57.45%，在CIN组织中的阳性表达率分别为32.26%、19.35%，在正常宫颈组织中的阳性表达率分别为9.68%、6.45%；明胶酶A在三组间阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=41.680，P=0.00）。TIMP-1因子在三组间阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=25.516，P=0.00）。明胶酶A及TIMP-1在宫颈癌有无淋巴转移之间，差异有统计学意义。明胶酶A及TIMP-1在宫颈癌组织中的阳性表达与肿瘤生长类型、临床分期、病理分级、组织类型、患者年龄之间，差异无统计学意义。结论明胶酶A高表达与宫颈癌的侵袭、转移及预后有较密切关系，明胶酶A可以作为判断预后的指标之一。

[关键词]明胶酶A；TIMP-1；基质金属蛋白酶；子宫颈癌

研究发现：恶性肿瘤的侵袭与转移首先是穿透其外周细胞外基质层，破坏肿瘤细胞的组织学屏障。明胶酶A（matrix metalloproteinases-A，MMP-2）是一类依赖钙、锌离子的内肽酶，与其内源性特效的组织金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1）共同介导细胞外基质的降解和组织重塑，以维持细胞外基质的稳定。在正常机体中明胶酶A及其抑制剂（TIMP－1）的活性均较低。明胶酶A的活性可以被生长因子、炎症因子等特异性刺激后上调，而TIMP-1活性不能同步增加，引起调节失衡，从而引起肿瘤细胞穿透其外周细胞外基质层继而形成转移[2]。国内外研究者发现：明胶酶A及其抑制剂（TIMP－1）与乳腺癌、膀胱癌、软骨肉瘤、神经胶质瘤等多种恶性肿瘤关系密切[1，2，5，6]。至于妇科肿瘤，目前该因子与子宫内膜癌及卵巢癌的关系已有报道[3，4]，但该因子与子宫颈癌的关系少有报道。本研究采用免疫组化S-P法检测明胶酶A和TIMP1在子宫颈癌中的表达，进一步分析两因子与子宫颈癌预后的关系，以期为宫颈癌的靶向治疗提供一定的理论依据。

表1　明胶酶A和TIMP-1在宫颈癌组织、CIN组织和正常宫颈中的表达情况

1　资料与方法

1.1一般资料

选取2007年1月～2009年12月浙江省湖州市中心医院病理及临床资料完整的子宫颈癌组织标本47例，31例CIN组织标本，其中子宫颈癌组患者年龄22～73岁，平均（58.3±10.5）岁，按照国际妇产科联盟（2009）临床分期标准，Ⅰa期22例，Ⅰb～Ⅱa期18例，Ⅲ～Ⅳ期以上7例；鳞癌36例，其中高分化13例，中分化14例，低分化9例；腺癌7例（黏液腺癌3例、恶性腺瘤4例）、其他类型癌4例（未分化癌1例、腺鳞癌2例、间叶肿瘤1例）；所有患者术前均未行放、化疗。选择同期因良性病变行全子宫全切除，经病理证实为正常宫颈组织31例为对照组，年龄21～75岁，平均（59.7±9.2）岁。三组患者年龄比较差异无统计学意义。所有宫颈癌患者均正规随访（失访10例，随访37例）。

1.2实验方法及结果判断

所有实验标本均由病理科提供临床资料完整的石蜡标本，由一位资深病理实验医师指导进行，按照免疫组织化学S-P二步法操作染色。实验组鼠抗人明胶酶A及TIMP-1单克隆抗体，S-P试剂盒均购自福州迈新生物有限公司，对照组以PBS代替一抗。结果判断由一位资深病理诊断医师指导，严格按试剂盒说明书判定。具体如下：400倍显微镜下观察所有受检标本，以细胞膜（或细胞胞浆）出现棕黄或黄色颗粒为阳性。随机取4个不同视野分别计数，根据阳性细胞百分比及染色强度进行综合评分，淡黄色为弱阳性，黄色为阳性，棕黄色为强阳性。按阳性细胞所占的百分率计分如下：＜5%为0分；5%～20%为1分；21%～45%为2分；46%～75%为3分；＞75%为4分；按染色强度计分如下：无着色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分，根据上述阳性细胞百分率及染色强度进行综合评分，总分0～1分为阴性（－）、2～3分为弱阳性（＋）、4～5分为阳性（＋＋）、6～7分为强阳性（＋＋＋）[3]。

1.3统计学处理

采用SPSS17.0软件包进行统计学分析，计数资料率的比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。相关性分析用Spearman相关分析。生存率Kaplan-Meier非参数法制作计算。

2　结果

2.1明胶酶A及TIMP-1在宫颈癌组织、CIN组织和正常宫颈中的表达情况分析

由表1可见：明胶酶A（MMP2）及其抑制剂TIMP-1表达以细胞膜或部分细胞浆被染成黄色或棕色为阳性细胞，染色淡黄色为弱阳性，不染色为阴性细胞（封三图3～6）。MMP2、TIMP-1在宫颈癌组织中的阳性表达率分别为80.85%、57.45%，在CIN组织中的阳性表达率分别为32.26%、19.35%，在正常宫颈组织中的阳性率表达分别为9.68%、6.45%；MMP2因子在三组间阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=41.680，P=0.00）。TIMP-1因子在三组间阳性率比较，差异有统计学意义（χ2=25.516，P=0.00）。随着宫颈病变的加重，MMP2、TIMP-1的阳性表达渐增加，MMP2/ TIMP-1比值渐增加，强阳性率渐增多。

2.2明胶酶A和TIMP-1在宫颈癌中表达的相关性分析

由表2可见：21例明胶酶A表达阳性的宫颈癌病例中，6例TIMP-1呈阳性表达，二者共表达为28.57%。18例明胶酶A表达阴性病例中，2例TIMP-1呈阴性表达，同时不表达为94.44%。经Spearman相关分析，两者之间呈负相关性（直线相关），相关系数r=-0.508，P=0.046。

表2　明胶酶A和TIMP-1在宫颈癌中表达的相关性分析（n）

2.3宫颈癌组织中明胶酶A（MMP2）和TIMP-1的阳性表达与各临床病理因素之间的关系

由表3可见：明胶酶A（MMP2）在宫颈癌组织中的阳性表达与肿瘤生长类型、组织类型、临床分期、病理分级、患者年龄之间，差异无统计学意义。明胶酶A在宫颈癌有淋巴转移中阳性率为95.45%，在无淋巴转移组织中阳性率为68.00%，差异有统计学意义（χ2= 6.013，P=0.016）。TIMP-1在宫颈癌组织中的阳性表达与肿瘤生长类型、组织类型、临床分期、病理分级、患者年龄之间，差异无统计学意义。TIMP-1在宫颈癌有淋巴转移中阳性率为77.27%，在无淋巴转移组织中阳性率为40.00%，差异有统计学意义（χ2=6.650，P=0.011）。

表3　宫颈癌组织中MMP2和TIMP-1的阳性表达与各临床病理因素的关系（n，%）

3　讨论

研究发现，上皮恶性肿瘤主要的生物屏障是肿瘤周围的细胞外基质，而细胞外基质的主要生化结构是由弹力纤维及胶原组成，Ⅳ型胶原为胶原中的主要成分[2]。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPS）是一组依赖钙、锌离子的内肽酶，可以水解血管细胞外基质及其基底膜，其中明胶酶A（又称MMP2）是分解Ⅳ型胶原主要基质金属蛋白酶之一，它在肿瘤的浸润、扩散和血管重建中起重要作用[7]。TIMP-1是人体内自然存在的明胶酶A特异性抑制剂，存在于体液和组织中，由结缔组织细胞及巨噬细胞产生。其作用机制如下[8]：①在酶原阶段，TIMP-1可与明胶酶A酶原形成稳定的复合体，从而阻碍明胶酶A自我活化。②TIMP-1通过氨基端功能区的半胱氨酸残基与活化的明胶酶A锌离子活性中心结合。③TIMP-1通过C端功能区与明胶酶A的除活性中心以外的其他部分以1：1比例结合，形成MMP2-TIMP-1复合物，从而阻断明胶酶A与其作用底物的结合。研究发现，在正常稳定状态的组织中，明胶酶A表达量较少，TIMP-1的表达与之相平衡，亦较少。当人体受到生长因子、炎症因子、肿瘤因子等刺激后，明胶酶A的表达强度可明显上升，若TIMP-1的表达强度增高较明胶酶A增高幅度小，两者的平衡失调，则会引起疾病的发生。本实验中明胶酶A及TIMP-1在正常宫颈组织中的表达相差甚微，分别为9.68%、6.45%；两者在CIN组中的表达分别为32.26%、19.35%，两者表达明显均较正常组增高，TIMP-1表达的升高，可能是由于机体明胶酶A增高时，通过反馈调节增加TIMP-1来抑制明胶酶A的活性；两者在宫颈癌中的表达分别为80.85%（其中强阳性16例）、57.45%（其中强阳性4例），明胶酶A的表达率及表达强度均明显高于TIMP-1；这一结论进一步证实了大部分学者的观点：当肿瘤侵袭或转移时，明胶酶A阳性率较TIMP-1明显上升[9]。

生理状态下，血管壁的细胞外基质通过明胶酶A与其抑制剂TIMP-1维持降解和新生之间的动态平衡。若肿瘤刺激因子等作用使二者平衡失衡，将会导致肿瘤细胞突破第一道物理屏障，造成肿瘤细胞游走，经过一系列的转化，渗透，直至完成对靶组织的侵袭。国外研究者早在1996年就发现明胶酶A在乳腺癌、胃肠道、垂体等肿瘤浸润和转移过程起到了重要的作用[5]。Chen等[10]、Al Rawashdeh等[11]均证实：明胶酶A作用于基质成分后可以分解纤维连接蛋白-5（FN-5）和层黏蛋白（LN），产生可溶性片段，具有催化功能，间接参与肿瘤的免疫过程。Tumer等[12]进一步研究发现明胶酶A表达阳性与肿瘤血管新生血管生成有关，确定了明胶酶A在肿瘤远处转移、种植中的至关重要的功能。

本研究结果显示：明胶酶A在宫颈癌中的表达与患者肿瘤生长类型、组织类型、病理分级、临床分期、年龄之间差异无统计学意义。明胶酶A在宫颈癌有淋巴转移组中阳性率为95.45%，在无淋巴转移组中阳性率为68.00%，差异有统计学意义（P＜0.05）。TIMP-1在宫颈癌中的表达与患者肿瘤生长类型、组织类型、病理分级、临床分期、年龄之间差异无统计学意义。TIMP-1在宫颈癌有淋巴转移中阳性率为77.27%，在无淋巴转移组织中阳性率为40.00%，差异有统计学意义（χ2=6.650，P=0.011）。进一步分析上述实验数据发现：21例明胶酶A表达阳性的宫颈癌病例中，6例TIMP-1呈阳性表达，二者共表达为28.57%。18例明胶酶A表达阴性病例中，2例TIMP-1呈阴性表达，同时不表达为94.44%。经Spearman相关分析，两者之间呈负相关性，相关系数r=-0.508，P=0.046。根据以上实验结果及相关文献报道，我们有理由认为：明胶酶A与宫颈癌的侵袭性有一定的关系，其作用机制可能因为TIMP-1的表达过低，无法控制明胶酶A对细胞外基质和基底膜的降解，从而使肿瘤的侵袭性增强，明胶酶A的过度表达可能使肿瘤内部血管增生，进一步增强肿瘤的增值能力，与大部分研究相一致[13-15]。

在后期的正规随访患者37例中，6例明胶酶A阳性及强阳性患者和2例TIMP-1阴性患者在5年内死亡。宫颈癌明胶酶A表达阳性与表达阴性患者之间的5年生存率比较，χ2=2.981，P=0.046，说明明胶酶A的阳性表达与预后相关，明胶酶A阳性表达强度越强，预后越差。

综上所述，本文研究结果表明：明胶酶A高表达与宫颈癌的侵袭、转移及预后有较密切关系，明胶酶A可以作为判断预后的指标之一。这一结论与蒋亚男等[16]的研究结果相一致。因此，从理论上来看，提高TIMP-1或TIMP-1片段的表达，以降低明胶酶A的活性可望成为恶性肿瘤的治疗新的思路。尹刚等[17]运用荧光蛋白转染的卵巢癌原位移植瘤动物模型进行药效实验，结果显示：黄芪、莪术配伍组能使卵巢癌细胞裸鼠移植瘤组织中MMP2的表达明显降低，表明通过下调MMP2而达到抑瘤效果。但这一思路可否用于其他恶性肿瘤（包括子宫颈癌）的靶向治疗，还有待于今后的大样本多中心研究。

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Expression and clinical significance of gelatinase A and its inhibitor TIMP-1 in cervical cancer

ZHANG Wenyuan DING Shengdi HUANG Xiaohong SHEN Junjun
Department of Gynaecology and Obstetrics, Huzhou Central Hospital in Zhejiang Province, Huzhou 313000, China

[Abstract]Objective To investigate expression and prognostic significance of gelatinase A and its inhibitor TIMP-1 in cervical cancer. Methods 47 cervical cancer tissue, 31 CIN tissue and 31 healthy cervical tissue specimens were detected by immunohistochemistry (S-P) to explore the positive expression of gelatinase A and its inhibitor TIMP-1, and the clinical materials of these patients were analyzed. Results The positive rate of gelatinase A and TIMP-1 were 80.85% and 57.45% in cervical cancer tissue, 32.26% and 19.35% in CIN tissue, and 9.68% and 6.45% in healthy cervical tissue. The differences in positive rate of gelatinase A among three groups were statistically significant (χ2=41.680, P= 0.00), and the differences in positive rate of TIMP-1 among three groups were also statistically significant (χ2=25.516, P=0.00). The differences in positive rates of gelatinase A and TIMP-1 between lymphatic metastasis and non-lymphatic metastasis were statistically significant. In cervical cancer tissue, the positive rates of gelatinase A and TIMP-1 showed no difference among various tumor types, clinical stages, pathological grades, tissue types, and ages of patients. Conclusion High expression of gelatinase A has close relation to invasion, metastasis and prognosis of cervical cancer, which can be used as an indicator for prognosis judgement.

[Key words]Gelatinase A; TIMP-1; Matrix metalloproteinase; Cervical cancer

[中图分类号]R737.3

[文献标识码]A

[文章编号]1673-9701（2016）03-0005-04

[基金项目]浙江省医药卫生科技计划项目（2015KYB378）

收稿日期：（2015-10-14）