王晓培　程家凤　郑茜茜

232001　安徽省淮南市，安徽理工大学附属东方医院



·论著·

JAK2V617F突变阳性骨髓增殖性肿瘤患者凝血功能异常及伴发血管性疾病的临床分析

王晓培程家凤郑茜茜

232001安徽省淮南市，安徽理工大学附属东方医院

【摘要】目的探讨JAK2V617F基因突变阳性骨髓增殖性肿瘤(MPN)患者常规凝血功能的改变及伴发血管性疾病的关系。方法收集2008年4月至2015年4月共68例MPN患者的临床资料和实验室检测结果，其中伴发血管性疾病28例，无血管性疾病40例。回顾性分析JAK2V617F基因突变与各项指标及血管性疾病间的关系。结果(1)68例MPN患者中存在JAK2V617F基因突变45例(66%)，其中27例(79%)真性红细胞增多症(PV)，16例(53%)原发性血小板增多症(ET)，2例(50%)原发性骨髓纤维化(PMF)。(2)MPN患者与正常健康对照组比较，血细胞计数及常规凝血指标差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)。其中JAK2V617F基因突变阳性患者与JAK2V617F基因突变阴性患者比较，血细胞计数及常规凝血指标差异有统计学意义(P<0.05)。(3)28例合并血管性疾病的MPN患者中，JAK2V617F基因突变阳性患者的血管性疾病发生率更高(P<0.05或<0.01)，且JAK2V617F基因突变阳性患者与JAK2V617F基因突变阴性患者比较，血细胞计数差异有统计学意义(P<0.01)。 结论MPN患者中JAK2V617F基因突变发生率较高，且JAK2V617F基因突变阳性患者的血细胞计数及凝血功能存在明显异常。JAK2V617F突变阳性患者的血栓危险因素如白细胞的升高较阴性者更显著，血管性疾病的发生率更高。初诊MPN患者检测JAK2V617F基因突变、血细胞计数、常规凝血指标可初步评估患者凝血功能，预防血管性并发症的发生。

【关键词】骨髓增殖性肿瘤；JAK2V617F基因突变；血栓形成；血常规；凝血功能

骨髓增殖性肿瘤(myeloproliferative neoplasms，MPNs)是一组以骨髓增殖为主要表现的血液系统疾病，主要包括真性红细胞增多症(polycythemia vera，PV)、原发性血小板增多症(essential thrombocythaemia，ET)及原发性骨髓纤维化(primary myelofibrosis，PMF)。近年来，多个MPN的分子生物学标志陆续被发现，如JAK2V617F、MPL、CALR等。其中，JAK2V617F突变的发现极大地影响了MPN患者的诊断和治疗，2008年WHO将有无JAK2V617F基因突变列为MPN主要的诊断指标之一。MPN患者寿命接近一般人群，死亡率升高主要由于并发血管性疾病。除了高龄、糖尿病等已知高危因素外，血细胞、凝血功能异常及JAK2V617F突变也在并发血管性疾病的过程中发挥着重要作用。本研究回顾性分析了我院近7年收治的MPNs患者，对其伴发血管性疾病及有无JAK2V617F突变状态下的实验室结果进行分析报道，提高对MPNs伴血管性疾病诊断、危险因素的认识。

1资料与方法

1.1一般资料

1.1.1MPN组:收集2008年4月至2015年4月在安徽理工大学附属东方医院血液科门诊及住院患者68例，其中男35例，女33例；年龄33～82岁，中位年龄65岁；PV患者34例，ET 30例，PMF 4例；合并血管性疾病的患者28例，PV 16例，ET 12例。

1.1.2健康对照组:均为门诊体检人员，共28例，男14例，女14例；年龄23～72岁，中位年龄45岁，均无高血压病、糖尿病及出凝血性疾病史，就诊前无服用相关药物史。

1.2诊断标准所有MPNs(PV、PMF、ET)诊断均符合2008年世界卫生组织有关MPN新标准进行分类[1]。血管性疾病包括脑梗死、短暂性脑缺血发作、深静脉血栓形成、脑出血、下肢动脉血栓形成。

1.3方法MPN患者及健康对照组人员均于清晨空腹采集静脉血，129 mmol/L枸橼酸钠9∶1抗凝，2 h内以3 000 r/min离心10 min，分离血浆，用于止凝血指标检测。PT、APTT、Fbg、D-D采用法国STAGO公司提供的试剂盒，在STA-Compact血凝仪上测定。PT、APTT检测采用磁珠凝固法，Fbg检测采用Glass法。采集EDTA 9∶1抗凝，静脉血1 ml用于血常规检测(WBC、RBC、PLT、Hb)。血常规采用美国Coulter公司提供的试剂盒，在Coulter公司血球计数仪上测定。采用等位基因特异性聚合酶链反应(allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR)技术。(1)基因组DNA提取：取患者外周血5 ml，按BIOMIGA血液基因组DNA提取试剂盒说明书抽提基因组DNA，DNA终浓度100～200 g/ml。(2)PCR扩增：参考文献[1]方法进行引物设计和PCR检测。(3)琼脂糖凝胶电泳：产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳后紫外光透视仪分析图像并拍照。PCR扩增产物电泳后，仅出现364 bp条带者为野生型，同时出现364 bp和203 bp条带者为突变型。

2结果

2.1JAK2V617F突变68例MPN患者中，共检出45例存在JAK2V617F突变，总突变率66%。34例PV患者中，JAK2V617F突变阳性27例，占79%。30例ET患者中，JAK2V617F突变阳性16例，占53%。4例PMF患者中，JAK2V617F突变阳性2例，占50%。正常对照组未检出JAK2V617F突变。

2.2MPN组与健康对照组血细胞计数及常规止凝血指标比较

表1　MPN组与健康对照组比较　±s

注：与健康对照组比较,*P<0.05,#P<0.01；与JAK2(-)比较,△P<0.05，☆P<0.01

2.2.1PV患者血细胞计数及常规止凝血指标检测:PV患者与正常健康对照组比较，PV组无论有无JAK2V617F突变，WBC、RBC、Hb及Fbg、D-D均较正常健康对照组升高(P<0.05或<0.01)，其中JAK2V617F突变阳性患者的WBC、RBC、Hb计数及Fbg、D-D升高更明显(P<0.01)。PV患者中有JAK2V617F突变者与无突变者比较，JAK2V617F突变阳性者的上述指标差异有统计学意义(P<0.05)。PT、APTT及PLT差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2.2ET患者血细胞计数及常规止凝血指标检测:ET患者与正常健康对照组比较，WBC、PLT及Fbg、D-D均较正常健康对照组升高(P<0.05或<0.01)。其中，ET组中JAK2V617F突变阳性患者的WBC、PLT计数及Fbg、D-D升高更加显著(P<0.01)。有无JAK2V617F突变者比较，突变阳性患者WBC、D-D升高明显(P<0.05)，PLT升高更显著(P<0.01)。PT、APTT、RBC、Hb差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2.3PMF患者血细胞计数及常规止凝血指标检测:与健康对照组比较，PMF患者Hb、PLT明显下降，WBC、D-D、Fbg升高(P<0.05或<0.01)，有JAK2V617F突变阳性患者，PLT下降及D-D、WBC升高更明显(P<0.01)。JAK2V617F突变阳性与突变阴性患者比较，阳性患者WBC、D-D变化差异有统计学意义(P<0.05或<0.01)。PT、APTT、RBC差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3MPN合并血管事件患者有无JAK2V617F突变的血细胞计数比较共有28例MPN患者合并血管性疾病，其中JAK2V617F突变阳性22例，JAK2V617F突变阴性6例。2组患者比较，JAK2V617F突变阳性者WBC及PLT计数均明显高于阴性者，差异有统计学意义(P<0.01)。Hb计数在2组患者中差异无统计学意义(P>0.05)。22例JAK2V617F突变阳性患者中，PV 13例(81%)，ET 9例(75%)。6例JAK2V617F突变阴性患者中，PV 3例(19%)，ET 3例(25%)。PV患者和ET患者，JAK2V617F突变阳性患者的血管性疾病发生率更高(P<0.05或<0.01)。6例JAK2V617F突变阴性患者中，既往发生过血管性疾病1例(14.3%)，22例JAK2V617F突变阳性者，既往发生过血管性疾病6例(85.7%)，JAK2V617F突变阳性患者血管性疾病再发率更高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2　MPN合并血管事件患者有无JAK2V617F突变的血细胞计数比较

注：与JAK2(-)比较，*P<0.05，#P<0.01

3讨论

MPNs是一组克隆性疾病，有克隆增殖的能力，可转化为骨髓纤维化或急性白血病，同时有发生诸如深静脉血栓等并发症的风险。JAK2V617F基因突变已成为Ph阴性MPNs的诊断性标志。JAK2V617F发生于JAK2基因12号外显子第1 894位碱基，该突变引起JAK/STAT信号通路异常激活，导致一系列调节细胞生存的细胞因子过度生成并最终引起疾病的发生。研究显示，JAK2V617F突变存在于65%～97%的PV患者，23%～57%的ET患者和35%～57%PMF患者中。在我们此次研究中，66%(45/68)的患者检测到存在JAK2V617F突变，其中PV组79.4%(27/34)，ET组53.3%(16.30)，PMF组50.0%(2/4)，符合相关文献报道[2-5]。

血栓形成是MPN患者就诊及死亡的主要原因之一。这类疾病的易栓状态发生机制包括正常血管细胞的异常和克隆的血细胞异常。除了高龄、血栓形成史、高血压、高脂血症、吸烟及糖尿病等MPNs易栓的高危因素，白细胞、红细胞及血小板的异常在血栓形成的过程中也发挥重要作用。

很多回顾性研究已经确定，白细胞增多是PV及ET患者血栓形成的独立危险因素，其作用机制可能与粒细胞、血小板和(或)内皮细胞之间的相互交叉作用有关。此外，白细胞通过促进动脉粥样硬化斑块中的炎症过程，也增加了血管性疾病发生率。在针对PV患者的ECLAP研究中发现，当患者白细胞计数>15×109/L时，血栓形成的风险明显高于白细胞<10×109/L 患者[6]。在一项包含776例ET患者的回顾性研究中，ET患者的白细胞计数与血栓形成风险有显著相关性[7]。在PMF患者，白细胞计数>15×109/L时，血栓形成风险增加。本次研究中发现，PV、ET及PMF患者无论有无JAK2V617F突变，白细胞数量均较健康对照组明显升高。在PV患者中，红细胞增多可通过增加血液粘稠度导致血栓形成，PV患者脑血管中尤为显著。除了红细胞数量增加外，在最近的CYTO-PV研究中发现，红细胞膜和细胞内容物的生化改变可能导致红细胞聚集，血流阻断，并诱发血小板-白细胞相互作用增强，最终导致缺血及梗塞[8]。本次研究中亦发现PV患者无论有无JAK2V617F突变，红细胞数量均较健康对照组升高，符合相关文献报道。

MPN患者可因MPN克隆的血细胞活化，宿主血管细胞通过获得性APC抵抗使凝血酶产生持续增加及促凝微粒在循环中水平升高，导致高凝状态。JAK2V617F突变阳性患者的游离PS、凝血素、因子V和组织因子通路抑制剂水平明显下降，尤其是等位基因负荷>50%的患者，可获得更多的APC抵抗，促进凝血系统的激活，参与动静脉血栓的形成。

多项研究中发现JAK2V617F突变与血栓形成有关，其影响血栓形成机制有：(1)通过修饰表面粘附分子引起红细胞粘附的增加，促进血栓形成；(2)通过改变TPO诱导的血小板启动中C-MPL信号转导的表达，导致血小板高反应性；(3)JAK2V617F活化通过MAPK和P13K通路也参与了中性粒细胞和单核细胞的TF表达。在ET及PV患者中，JAK2V617F突变阳性患者的动静脉血栓风险明显增加，且突变等位基因负荷与血栓发生风险呈正相关。一项包括ET及PV患者的回顾性研究中发现，JAK2V617F突变等位基因负荷>50%的患者血管并发症的发生率最高，等位基因负荷>75%的患者总血栓相对风险可增加3.56倍[9]。同样有研究表明JAK2V617F突变是PMF患者动静脉血栓形成的独立危险因素[10]。

本次研究通过对68例MPN患者的分组研究，分别检测外周血细胞、常规凝血功能，并与正常对照组比较，发现无论有无JAK2V617F突变，均存在外周血细胞数量的异常，同时有凝血亢进、纤溶激活及抗凝血的抑制等止凝血功能的改变。在对患者有无JAK2V617F突变进行比较后，发现上述改变在JAK2V617F突变阳性患者中更为显著。而进一步通过对14例合并血管性疾病的MPN患者进行分析后，发现JAK2V617F突变阳性患者的血栓危险因素如白细胞的升高较阴性者更显著，血管性疾病的发生率更高。

MPNs除了JAK2V617F突变外，存在其它众多基因突变，如JAK外显子12、MPL、CALR、IZF1、TP53、TET2、ASXL1、IDH1/2及EZH2和SRSF2突变。大约10%PMF患者和1%的ET患者具有MPL基因突变(MPL W515)，伴MPL突变ET与高血小板计数、微血管症状及诊断后动脉血栓高风险相关。2013年研究发现，在无JAK2V617F突变或MPL突变的ET、PMF及不典型慢性粒细胞白血病患者中，部分存在CALR突变[11,12]。相比较于JAK2V617F突变阳性患者，CALR突变阳性的ET及PMF患者血栓发生率较低[13]，且白血病转化率低，对IFN-α治疗反应较好，提示更佳的预后[13-15]。

综上所述，MPN患者的外周血细胞及凝血功能检测异常与其高凝状态是一致的。这类疾病血液活化的机制是多因素的，是血栓形成的基础，而JAK2V617F突变及高JAK2V617F突变等位基因负荷与血栓危险增加密切相关，是血栓形成新的危险因素。初诊MPN患者检测JAK2V617F突变、血常规及常规凝血指标，可有效评估凝血状态及发生血栓的风险。JAK2V617F突变阴性的ET及PMF患者，如条件允许，需行CALR突变及MPL突变的检测，帮助更好的判断预后。

参考文献

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Analysis for the coagulation disorder and complicated vascular diseases in patients with JAK2V617F mutation-positive myeloproliferative neoplasms

WANGXiaopei,CHENGJiafeng,ZHENGQianqian.

DongfangHospitalAffiliatedtoAnhuiUniversityofScienceandTechnology,Anhui,Huainan232001,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes of routine blood coagulation function of patients with JAK2V617F mutation-positive myeloproliferative neoplasms (MPN) and its relationship with vascular diseases.MethodsThe clinical data and laboratory examination results of 68 patients with MPN from April 2008 to April 2015 were collected, including 28 patients with complicated vascular diseases (case group) and 40 patients without vascular diseases (control group). The correlation between JAK2V617F gene mutation and different parameters as well as vascular diseases was retrospectively analyzed.ResultsAmong 68 patients with MPN, there were 45 cases (66%) with JAK2V617F gene mutation,including 27 cases of polycythemia vera (PV,79%), 16 cases of essential thrombocythemia (ET, 53%) and 2 cases of primary myelofibrosis (PMF,50%). There were significant differences in blood cell count and routine blood coagulation parameters between case group and control group (P<0.05 or P<0.01).Moreover there were significant differences in blood cell count and routine blood coagulation parameters between JAK2V617F mutation-positive patients and JAK2V617F mutation-negative patients (P<0.05). Among 28patients with MPN complicated by vascular diseases, the incidences of vascular diseases in JAK2V617F mutation-positive patients were significantly higher than those in JAK2V617F mutation-negative patients (P<0.05 or P<0.01). ConclusionThe incidence of JAK2V617F gene mutation in patients with MPN is relatively higher,moreover, there exist significant abnormalities in blood cell count and blood coagulation function of JAK2V617F mutation-positive patients. The risk factors of thrombosis pathogenesis in JAK2V617F mutation-positive patients are more higher than those in JAK2V617F mutation-negative patients,moreover,the incidences of vascular diseases are relatively higher. To detect JAK2V617F mutation, blood cell counts and routine blood coagulation parameters in patients with MPN of preliminary diagnosis can evaluate blood coagulation function of patients initially and prevent the occurrence of vascular complications.

【Key words】myeloproliferative neoplasms;JAK2V617F mutation; thrombosis;blood routine test;blood coagulation function

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2016.11.005

【中图分类号】R 733.3

【文献标识码】A

【文章编号】1002-7386(2016)11-1617-04

(收稿日期：2015-11-07)