章银良，卢慢慢，张陆燕（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450001）



鱼肉蛋白- D-木糖MRPs抗氧化活性的研究

章银良，卢慢慢，张陆燕
（郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450001）

摘要：为分析实际体系美拉德反应产物（MRPs）的抗氧化活性，采用4种不同品种鱼肉（鲢鱼、草鱼、鲫鱼和鲤鱼）蛋白与D-木糖建立实际体系进行美拉德反应，反应产物通过恒温油浴加热制备，以DPPH自由基（DPPH·）作为美拉德反应产物抗氧化活性的测定指标。单因素试验考察加热温度、时间、pH及反应底物质量比对美拉德反应的影响，优化出MRPs抗氧化活性最强的鲫鱼蛋白-D-木糖为实际反应体系。均匀试验结果表明，鲫鱼蛋白-D-木糖实际体系MRPs对DPPH自由基的清除率最高，抗氧化活性最强。且最佳工艺条件为：反应时间70min，温度136℃，初始pH 12.0及反应底物质量比（鲫鱼蛋白∶D-木糖）为3∶1。

关键词：美拉德反应；实际体系；抗氧化活性；鱼肉；D-木糖

美拉德反应（Maillard reaction，MR）又称为非酶褐变反应，主要是指在食品加工和储存的过程中含氨基的化合物（蛋白质、氨基酸及肽类）与含羰基化合物（还原糖）之间发生的一系列复杂反应［1］。美拉德反应是加工食品的色泽和芳香风味的重要来源，其反应历程可分为3个阶段：初级阶段，中级阶段和高级阶段。初级阶段主要进行羰氨的缩合及分子重排，生成不挥发性风味物质的前体成分；中级阶段主要发生3个途径，分别是在酸性、碱性和高温下进行，生成醛类和酮类等物质；高级阶段主要发生醇醛的缩合及生成类黑精物质的聚合反应［2-3］。影响美拉德反应的因素有很多，如氨基酸及糖的种类和性质、水分活度、加热时间、加热温度、反应pH、反应底物质量比、金属离子及缓冲液浓度等［4-6］。美拉德反应最终生成棕色甚至是黑色的大分子物质类黑精或称拟黑素［7］。MRPs具有多种多样的生物活性如抗氧化［8］、抗诱变［9］、抗增殖［10］等，尤其是类黑精素、还原酮及一些含N、S的杂环化合物具有较强的抗氧化活性，甚至可与常用的食品抗氧化剂BHA、BHT相媲美［11］。

对于美拉德反应的研究较多集中在模式体系而对实际体系的研究较少，本文以鱼肉蛋白-D-木糖建立实际体系进行美拉德反应并制备其产物，以DPPH自由基（DPPH·）作为反应抗氧化活性的测定指标，选出最佳鱼肉蛋白-D-木糖实际体系组合，并优化出最佳工艺条件，为后期研究不同加工技术、不同反应溶剂对实际体系美拉德反应的影响打下良好的理论基础。

1　材料与方法

1.1试验材料

鱼为鲢鱼（蛋白含量18.6%）、草鱼（蛋白含量16%）、鲫鱼（蛋白含量13%）、鲤鱼（蛋白含量20%）：河南郑州高新区莲花市场；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），分析纯：上海生工生物工程技术服务有限公司；无水乙醇、D-木糖等均为分析纯：阿拉丁公司。

1.2主要仪器设备

HH-1智能型数显恒温油浴槽：巩义市予华仪器有限公司；UV-2102pc紫外可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；电子天平：奥豪斯（上海）仪器有限公司；pH计：瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3方法

1.3.1鱼肉蛋白-D-木糖实际体系美拉德反应产物的制备

美拉德反应产物的制备参考章银良［12］等文献中的制备方法并做适当修改。

首先是鲜鱼材料的前处理，鱼需进行去头、去皮、去刺等处理，然后将纯鱼肉进行绞碎并换算成相应鱼蛋白含量的量待用。影响美拉德反应的因素主要有加热时间、加热温度、反应初始pH和反应底物质量比，因此可按上述4个因素依次进行单因素试验。制备美拉德反应产物的具体操作步骤如下：

1）温度对美拉德反应产物抗氧化能力的影响：准确称量鲢鱼蛋白（鲢鱼肉糜3.36 g）、草鱼蛋白（草鱼肉糜3.91 g）、鲫鱼蛋白（鲫鱼肉糜4.81 g）、鲤鱼蛋白（鲤鱼肉糜3.16 g）分别与D-木糖0.63 g（质量比1∶1）用去离子水进行溶解后调pH为7.0，并定容至25 mL，将反应液转移至圆底烧瓶中，密封严实后，将恒温油浴锅调至50℃进行反应60 min，反应结束后迅速将反应液置于冰水中冷却、过滤、取滤液待用。并按上述方法依次在75、100、125、150、175℃条件下制备美拉德反应液后进行相关测定。

2）加热时间对美拉德反应产物抗氧化能力的影响：准确称量鲢鱼蛋白（鲢鱼肉糜3.36 g）、草鱼蛋白（草鱼肉糜3.91 g）、鲫鱼蛋白（鲫鱼肉糜4.81 g）、鲤鱼蛋白（鲤鱼肉糜3.16 g）分别与D-木糖0.63 g（质量比1∶1）用去离子水进行溶解后调pH为7.0，并定容至25 mL，将反应液转移至圆底烧瓶中，密封严实后，将恒温油浴锅调至125℃进行反应30 min，反应结束后迅速置于冰水中冷却、过滤、取滤液待用。并按上述方法依次加热60、90、120、150、180 min制备美拉德反应液后进行相关测定。

3）反应初始pH组对美拉德反应产物抗氧化能力的影响：准确称量鲢鱼蛋白（鲢鱼肉糜3.36 g）、草鱼蛋白（草鱼肉糜3.91 g）、鲫鱼蛋白（鲫鱼肉糜4.81 g）、鲤鱼蛋白（鲤鱼肉糜3.16 g）分别与D-木糖0.63 g（质量比1∶1）用去离子水进行溶解后调pH为4.0，并定容至25 mL，将反应液转移至圆底烧瓶中，密封严实后，将恒温油浴锅调至125℃进行反应60 min，反应结束后迅速置于冰水中冷却、过滤、取滤液待用。并按上述方法用4 mol/L的HCl溶液和6 mol/L的NaOH溶液依次调pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0制备美拉德反应液后进行相关测定。

4）反应底物对美拉德反应产物抗氧化能力的影响：准确称量鲢鱼蛋白（鲢鱼肉糜3.36 g）、草鱼蛋白（草鱼肉糜3.91 g）、鲫鱼蛋白（鲫鱼肉糜4.81 g）、鲤鱼蛋白（鲤鱼肉糜3.16 g）分别与D-木糖0.63 g（质量比1∶1）用去离子水进行溶解后调pH为7.0，并定容至25 mL，将反应液转移至圆底烧瓶中，密封严实后，将恒温油浴锅调至125℃进行反应60 min，反应结束后迅速将反应液置于冰水中冷却、过滤、取滤液待用。并按上述方法依次称量4种不同鱼蛋白和D-木糖质量比为1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、1∶3、1∶2.5、1∶2、1∶1.5制备美拉德反应液后进行相关测定。

1.3.2DPPH自由基清除能力的测定

根据Yen G等［13］文献中测定DPPH·清除能力的方法来评价MRPs的抗氧化活性，先配置0. 12 mmol/L的DPPH酒精溶液（最好现用现配），避光保存。取1 mL稀释50倍后的样品溶液，再加4 mL DPPH酒精溶液，摇匀，放在室温条件下避光反应30 min。然后用紫外可见分光光度计在517 nm的条件下测定其吸光度值，记为AS。以相同的方法取1 mL的去离子水代替稀释后的样品溶液作为控制组，在517 nm条件下测定其吸光度值，记为Ac。计算DPPH自由基清除率方程式如下所示：

2　结果与分析

2.1单因素试验结果

2.1.1不同加热温度对美拉德反应产物抗氧化活性的影响

加热温度不仅影响着美拉德反应的速度，而且对美拉德反应产物的浓度及它们之间的相互作用也有一定的影响见图1。

如图1所示，在加热初期，MRPs对DPPH自由基的清除率随着温度的升高增加缓慢。随后则随着加热温度的升高几乎呈线性趋势增加，在150℃时，4个组合的抗氧化活性均达到最强，可知MRPs中的抗氧化活性物质在高温条件下更有利于生成，其中鲫鱼蛋白-D-木糖组合的清除率为17.98%，略高于其它3个组合。

图1　不同加热温度下实际体系MRPs对DPPH自由基清除率的变化Fig.1 The change of different heating temperatures on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

2.1.2不同加热时间对美拉德反应产物抗氧化活性的影响

不同加热时间对美拉德反应产物抗氧化活性的影响见图2。

图2　不同加热时间下实际体系MRPs对DPPH自由基清除率的变化Fig.2 The change of different heating time on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

由图2可以看出，加热时间对美拉德反应抗氧化活性物质的生成具有较强的影响力，随着加热时间的延长，4个组合MRPs对DPPH自由基的清除率均显著增强。

2.1.3不同反应初始pH对美拉德反应产物抗氧化活性的影响

不同反应初始pH对美拉德反应产物抗氧化活性的影响见图3。

图3　不同反应初始pH下实际体系MRPs对DPPH自由基清除率的变化Fig.3 The change of different reaction initial pH on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

由图3可知，酸性和碱性条件有利于美拉德反应抗氧化活性物质的生成，在pH7.0～12.0的范围内，MRPs的抗氧化活性逐渐增加，可能是由于随着pH的增加，羰-氨反应产生的吡嗪类物质的种类和产量也增加。羰氨缩合后，糖通过反醇醛、烯醇化和脱水反应进行降解，这些反应都具有碱催化作用。且4个组合均在pH 12.0时抗氧化活性达到最强，鲫鱼蛋白-D-木糖最高为40.59%。

2.1.4不同底物质量比对美拉德反应产物抗氧化活性的影响

不同底物质量比对美拉德反应产物抗氧化活性的影响见图4。

图4　不同反应底物比例下实际体系MRPs对DPPH自由基清除率的变化Fig.4 The change of different reaction substrate ratio on DPPH radical scavenging activity of actual system MRPs

由图4可知，底物质量比对实际体系美拉德反应产物抗氧化活性的影响表明，在鱼肉蛋白质含量与D-木糖比例小于1范围内，随着鱼肉含量的增加MRPs抗氧化活性显著减小；在鱼肉蛋白质与D-木糖比例大于1范围时，随着鱼肉含量的增加MRPs抗氧化活性增加显著，当鱼肉蛋白与D-木糖的比例为3∶1时抗氧化活性达到最高。图4还表明，在美拉德反应中，底物中糖类与蛋白质质量相接近时，MRPs抗氧化活性最低，固定鱼肉含量，随着D-木糖含量的增加MRPs抗氧化活性缓慢升高。固定D-木糖含量，随着鱼肉蛋白质含量增加MRPs抗氧化活性增加比D-木糖要快，由此可预见，鱼肉蛋白相对于D-木糖而言，对实际体系美拉德反应产物的生成更具有关键性的作用。

2.2均匀试验

2.2.1均匀试验因素水平设计

单因素试验结果表明鲫鱼蛋白-D-木糖组合的美拉德反应产物的抗氧化活性均高于其它3个组合。因此，下一步进行均匀试验优化鲫鱼蛋白-D-木糖组合优化出反应的最佳工艺条件。以DPPH自由基清除率为检测指标，采用U6*（64）［13］均匀试验表，因素水平表见表1。

表1　U6 *（64）均匀试验因素水平表Table 1 Levels and factors of U6*（64）uniform experiment

表2　均匀试验结果Table 2 Results of uniform experiment

2.2.3软件分析

采用Mathematics 4. 0软件对均匀试验结果进行分析，得到结果见表3、表4。

表3　回归参数表Table 3 Regression parameter table

表4　回归方差分析表Table 4 Regression analysis of variance table

Mathematics 4.0软件分析结果表明，反应初始pH 对MRPs抗氧化活性具有极显著影响，加热时间和初始pH之间及加热温度和初始pH之间均具有交互作用，并对MRPs抗氧化活性的影响极显著。影响MRPs抗氧化活性的主次顺序依次为：pH（X3）＞时间（X1）＞温度（X4）＞质量比（X2）。

回归方程：Y（自由基清除率）=35.721-1.44808X1X30.1+ 97.136 7X30.5-7.955 84×10-6X12X2-0.000 894 773X3X42。在测试条件范围内，经过计算后的最佳优化条件为：温度136℃、反应时间70 min、反映初始pH 12. 0、鲢鱼蛋白与木糖质量比3∶1，此时MRPs抗氧化活性最强，对DPPH自由基的理论清除率为44.35%。经试验验证在此优化条件下得到的MRPs对DPPH自由基的清除率为43.29%，与理论值的相对误差2.39%，超过各试验值。说明均匀试验优化后的最优条件组合制备的MRPs具有最强的抗氧化活性，优化结果可靠。

3　讨论与结论

以4种不同品种鱼肉（鲢鱼、草鱼、鲫鱼和鲤鱼）与D-木糖进行实际体系美拉德反应，通过普通油浴加热制备不同反应条件下的美拉德反应产物，以DPPH自由基（DPPH·）作为美拉德反应产物抗氧化活性的测定指标，利用单因素试验、探索加热温度、时间、pH及反应底物质量比对美拉德反应的影响，并选出MRPs抗氧化活性最强的鱼肉蛋白-D-木糖实际体系组合。由单因素试验结果可知，实际体系美拉德反应产物的抗氧化能力随着反应温度的升高和反应时间的延长而逐渐增强，反应初始pH为12.0时MRPs的抗氧化活性最强，增加反应底物鱼蛋白的浓度则有利于提高MRPs的抗氧化能力，且鲫鱼蛋白-D-木糖组合对DPPH自由基（DPPH·）清除率最高，MRPs的抗氧化活性最强。对鲫鱼蛋白-D-木糖进行均匀试验优化出最佳工艺条件。结果表明：最佳工艺条件为：反应时间70 min，温度136℃，初始pH 12.0及反应底物质量比（鲫鱼蛋白∶D-木糖）为3∶1。反应初始pH对MRPs抗氧化活性具有极显著影响，加热时间和初始pH之间及加热温度和初始pH之间均具有交互作用，并对MRPs抗氧化活性的影响极显著，经由均匀试验优化反应条件后所制备的美拉德反应产物，其抗氧化能力得到显著提高，抗氧化能力最强。

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Study on Antioxidant Activities of Maillard Reaction Products Derived from Fish Protein-D-xylose

ZHANG Yin-liang，LU Man-man，ZHANG Lu-yan
（School of Food & Bioengineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou 450001，Henan，China）

Abstract：The purpose was to optimize the antioxidant activity of Maillard reaction products（MRPs）derived from four different varieties of fish protein silver carp，grass carp，crucian carp，carp and D-xylose actual system，the preparation of reaction producted by constant temperature oil bath heating and DPPH radical-scavenging activity was described as the antioxidant activity indicator.The temperature，retention time，pH and mass ratio were taken into consideration，selecting MRPs strongest antioxidant activity of fish protein-D-xylose actual system combination，the optimize conditions from uniform test. The optimal conditions were retention time 70 min，temperature 136℃，pH 12.0，mass ratio（crucian carp protein∶D-xylose）3∶1.

Key words：maillard reaction；actual system；antioxidant activity；fish；D-xylose

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.009

作者简介：章银良（1963—），男（汉），教授，博士，主要研究方向：食品科学与质量安全。

收稿日期：2015-03-10