siRNA靶向沉默Lipocalin-2基因下调MMP-9表达对降低人肺癌A549细胞的侵袭、迁移能力的影响

2016-06-08马小刚杨晓光任敬赵峥

河北医药 2016年2期

马小刚　杨晓光　任敬　赵峥

马小刚杨晓光任敬赵峥

【摘要】目的利用针对Lipocalin-2的小干扰RNA(siRNA)，观察Lipocalin-2基因沉默对人肺癌A549细胞MMP-9表达及侵袭、迁移能力的影响。方法采用Real-time PCR和Western blot检测Lipocalin-2在3种肺癌细胞株(A549、NCI-H661、NCI-H446)及正常人支气管上皮细胞(HBE)的表达情况。设计并构建靶向Lipocalin-2的siRNA转染A549细胞，采用Real-time PCR和Western blot检测转染效率及Lipocalin-2基因沉默对MMP-9 mRNA和蛋白表达的影响。Transwell小室检测细胞侵袭能力。细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果Lipocalin-2 mRNA和蛋白在肺癌A549、NCI-H661、NCI-H446细胞株中的表达水平均显著高于HBE细胞，差异有统计学意义(P＜0.05)。siRNA-Lipocalin-2转染组Lipocalin-2 mRNA和蛋白表达水平与阴性对照组和空载体对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05); siRNA-Lipocalin-2转染组MMP-9 mRNA和蛋白表达水平与阴性对照组和空载体对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05); siRNA-Lipocalin-2转染组穿膜细胞数、平均迁移距离与阴性对照组和空载体对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。结论Lipocalin-2基因沉默通过下调MMP-9表达降低了人肺癌A549细胞的侵袭和迁移能力。

【关键词】肺癌; Lipocalin-2; MMP-9; A549细胞;侵袭;迁移

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率和致死率极高，远处转移早，患者预后差。脂质运载蛋白-2 (Lipocalin-2)是载脂蛋白家族成员之一，在调节脂代谢、渗透压及抗炎方面发挥重要作用。近年来，国外研究发现Lipocalin-2与乳腺癌等恶性肿瘤发病密切相关，在肿瘤细胞凋亡、黏附、浸润转移等过程中扮演重要角色［1］。基质金属蛋白酶-9(MMP-9)因其降解细胞外基质和基膜的作用，参与了肿瘤的侵袭转移过程［2］。本课题组前期研究发现Lipocalin-2、MMP-9在肺癌患者血清中异常高表达，提示二者可能参与肺癌发生发展、侵袭转移过程［3］。本研究通过构建靶向Lipocalin-2基因的小干扰RNA(siRNA)，将其转染肺癌A549细胞，旨在观察Lipocalin-2基因沉默对肺癌A549细胞侵袭和迁移能力的影响及其可能机制，为研究肺癌发病机制及治疗措施提供实验依据。

1材料与方法

1.1材料正常人支气管上皮细胞株HBE、人肺腺癌细胞株A549、人大细胞肺癌细胞株NCI-H661、人小细胞肺癌细胞株NCI-H446购自中国协和医科大学细胞中心。靶向Lipocalin-2基因的siRNA片段(siRNALipocalin-2)由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。DMED、胎牛血清购自美国GIBCO公司。Lipofectamin 2000、Trizol、实时荧光定量试剂盒购自美国Promega公司。兔抗Lipocalin-2、MMP-9、β-actin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。细胞裂解液、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒、高灵敏度化学发光检测试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司。PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)反转录试剂盒购自日本Takara公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养及转染:人肺癌细胞株(A549、NCIH661、NCI-H446)和人正常肺支气管上皮细胞株HBE均置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5% CO2孵箱中培养，每天换液1次。选取生长状态良好的细胞进行实验。采用Lipofectamin 2000将siRNALipocalin-2转染A549细胞。细胞用0.25%胰酶消化后接种于6孔板中，调整细胞密度为1×105个/孔。待细胞生长至80%～90%融合时，胰酶消化、收集细胞，随机分为阴性对照组(未进行转染的A549细胞)、空载体对照组(转染空病毒载体)、转染组(转染过表达Lipocalin-2慢病毒载体)，继续培养96 h。

1.2.2Real-time PCR:根据GeneBank中人Lipocalin-2、MMP-9 mRNA序列，采用Primer 5.0软件设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。Trizol提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，反转录合成cDNA第1链。以此链为模板采用ABI7300型荧光定量PCR仪扩增Lipocalin-2、MMP-9 mRNA片段，以GAPDH为内参照基因，目的基因表达相对值RQ=2ΔΔCt。见表1。

表1　Real-time PCR引物序列及扩增产物长度

1.2.3Westernblot:细胞用预冷PBS洗2次，加入RIPA裂解液200 μl裂解细胞，4℃、15 000 g离心30 min，取上清，BCA法进行蛋白定量。取100 μg总蛋白进行10% SDSPAGE电泳，目的蛋白转移至PVDF膜上。10%脱脂奶粉室温震荡封闭2 h后加入兔多克隆抗人Lipocalin-2(1∶2 000稀释)和鼠单克隆抗人βactin(1∶2 000稀释)一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(1∶5 000稀释)，37℃孵育2 h，PBST洗膜3次，ECL化学发光法显色、定影。用UVP软件扫描测定蛋白条带IOD值，作为内参照，以目的蛋白与β-actin吸光度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.2.4Transwell侵袭实验:细胞转染24 h后胰酶消化、收集细胞，用无血清RPMI-1460完全培养基重悬细胞，细胞密度为1×105个/ml，将细胞接种于8 μm孔径膜的Transwell小室上室，下室为500 μl含10% PBS的RPMI-1460完全培养基，培养6 h。用棉签擦拭掉膜上未迁移细胞，迁移并黏附在下室的细胞用4%多聚甲醛固定，进行HE染色。随机选取膜上有代表性的5个高倍镜下视野计数穿膜细胞数，取3个复孔的均值表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.2.5细胞划痕实验:将处于对数生长期的细胞按

1×105个/ml铺在6孔培养板中，待细胞达到80%～90%融合时，尽量垂直于细胞上用无菌枪头划出一条细痕，PBS清洗3次，去除漂浮细胞，再加入含2.5%胎牛血清的DMEM培养基，置于37℃、5% CO2培养箱培养24 h，4%多聚甲醛固定，显微镜下通过测量划痕宽度代表迁移能力。

1.3统计学分析应用SPSS 10.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1Lipocalin-2在HBE及不同肺癌细胞株中的表达Lipocalin-2 mRNA和蛋白在肺癌A549、NCI-H661、NCI-H446细胞株中的表达水平均显著高于HBE细胞，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2、3。

表2　Lipocalin-2 mRNA在HBE及不同肺癌细胞株中的表达情况　±s

类别GAPDH　Lipocalin-2　Lipocalin-2/GAPDH HBE　42.34±6.47　1.65±0.34　0.04±0.01 NCI-H661　44.12±6.35　8.54±1.12　0.19±0.02*NCI-H446　40.16±5.23　5.42±0.57　0.13±0.02*A549　41.36±5.22　8.56±0.87　0.21±0.03*

表3　Lipocalin-2蛋白在HBE及不同肺癌细胞株中的表达情况　±s

注:与HBE细胞比较，*P＜0.05

类别　β-actin　Lipocalin-2　Lipocalin-2/β-actin HBE　53.22±7.13　1.76±0.34　0.03±0.01 NCI-H661　55.06±6.87　8.81±1.12　0.16±0.02*NCI-H446　51.39±5.06　7.66±0.85　0.15±0.02*A549　50.52±6.45　9.77±0.87　0.19±0.03*

2.2siRNA-Lipocalin-2对A549细胞中Lipocalin-2表达的影响Real-time PCR结果显示，与阴性对照组和空载体对照组比较，siRNA-Lipocalin-2转染组Lipocalin-2 mRNA表达水平分别下调了(75.0±2.67)%和(73.68±2.34)%，差异有统计学意义(P＜0.05);阴性对照组和空载体对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。Western blot结果显示，与阴性对照组和空载体对照组比较，siRNA-Lipocalin-2转染组Lipocalin-2蛋白表达水平分别下调了(72.22±2.13)%和(68.75±2.06)%，差异有统计学意义(P＜0.05);阴性对照组和空载体对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。说明siRNA-Lipocalin-2能够明显抑制A549细胞中Lipocalin-2 mRNA和蛋白表达。见表4、5。

表4　siRNA-Lipocalin-2对A549细胞中Lipocalin-2 mRNA表达的影响　±s

注:与阴性对照组比较，*P＜0.05;与空载体对照组比较，#P＜0.05

组别GAPDH　Lipocalin-2　Lipocalin-2/GAPDH阴性对照组42.44±5.12　8.45±0.92　0.20±0.03空载体对照组　43.11±5.23　8.38±1.05　0.19±0.02转染组　42.35±5.06　2.21±0.25　0.05±0.01*#

表5　siRNA-Lipocalin-2对A549细胞中Lipocalin-2蛋白表达的影响　±s

注:与阴性对照组比较，*P＜0.05;与空载体对照组比较，#P＜0.05

组别　β-actin　Lipocalin-2　Lipocalin-2/β-actin阴性对照组76.12±8.35　13.57±2.12　0.18±0.02空载体对照组　78.62±8.45　12.39±2.03　0.16±0.03转染组　80.34±9.32　3.68±0.54　0.05±0.01*#

2.3siRNA-Lipocalin-2对A549细胞中MMP-9表达的影响Real-time PCR结果显示，与阴性对照组和空载体对照组比较，siRNA-Lipocalin-2转染组MMP-9 mRNA表达水平分别下调了(65.63±3.27)%和(67.65±2.54)%，差异有统计学意义(P＜0.05);阴性对照组和空载体对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。Western blot结果显示，与阴性对照组和空载体对照组比较，siRNA-Lipocalin-2转染组MMP-9蛋白表达水平分别下调了(61.54±2.02)%和(60.0±2.13)%，差异有统计学意义(P＜0.05);阴性对照组和空载体对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。说明siRNA-Lipocalin-2能够明显下调了A549细胞中MMP-9 mRNA和蛋白表达。见表6、7。

表6　siRNA-Lipocalin-2对A549细胞中MMP-9 mRNA表达的影响　±s

组别GAPDH　MMP-9　MMP-9/GAPDH阴性对照组38.67±5.06　12.21±1.77　0.32±0.05空载体对照组　39.21±5.32　13.43±1.85　0.34±0.06转染组　37.22±4.87　4.23±0.44　0.11±0.02*#

2.4siRNA-Lipocalin-2对A549细胞侵袭能力的影响Transwell小室结果显示，siRNA-Lipocalin-2转染组穿膜细胞数［(10±0.68)个］明显低于阴性对照组［(32±4.99)个］和空载体对照组［(34±4.76)个］。与阴性对照组和空载体对照组比较，siRNA-Lipocalin-2转染组穿膜细胞数分别减少了(68.75±7.41)%和(70.59±7.54)%，差异有统计学意义(P＜0.05);阴性对照组和空载体对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。说明siRNA-Lipocalin-2慢病毒载体转染明显降低了A549细胞的侵袭能力。见表8。

表7　siRNA-Lipocalin-2对A549细胞中MMP-9蛋白表达的影响　±s

注:与阴性对照组比较，*P＜0.05;与空载体对照组比较，#P＜0.05

组别　β-actin　MMP-9　MMP-9/β-actin阴性对照组53.21±6.55　13.67±2.54　0.26±0.05空载体对照组　55.06±7.12　13.85±2.77　0.25±0.06转染组　53.68±7.04　5.34±0.36　0.10±0.01*#

表8　siRNA-Lipocalin-2对A549细胞侵袭能力的影响　个，±s

注:与阴性对照组比较，*P＜0.05;与空载体对照组比较，#P＜0.05

组别　穿膜细胞数阴性对照组32.1±5.0空载体对照组　34.0±4.8转染组　10.3±0.7*#

2.5siRNA-Lipocalin-2对A549细胞迁移能力的影响

Transwell小室结果显示，siRNA-Lipocalin-2转染组平均迁移距离［(0.47±0.07)个］明显短于阴性对照组［(1.54±0.23)个］和空载体对照组［(1.50± 0.21)个］。与阴性对照组和空载体对照组比较，siRNA-Lipocalin-2转染组平均迁移距离分别减少了(69.48±6.85)%和(68.67±6.12)%，差异有统计学意义(P＜0.05);阴性对照组和空载体对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。说明siRNA-Lipocalin-2慢病毒载体转染明显降低了A549细胞的迁移能力。见表9。

表9　siRNA-Lipocalin-2对A549细胞迁移能力的影响　mm，±s

注:与阴性对照组比较，*P＜0.05;与空载体对照组比较，#P＜0.05

组别迁移距离阴性对照组1.54±0.23空载体对照组　1.50±0.21转染组　0.47±0.07*#

3　讨论

Lipocalin-2是1993年Kjeldsen等［4］在中性粒细胞中发现和分离的一种脂质运载蛋白，广泛分布在肺、肝、乳腺、肾脏、结肠、前列腺等人体组织。大量研究证实，Lipocalin-2生物学功能广泛，在肥胖、胰岛素抵抗、代谢综合征、血管病变、炎性反应等方面发挥关键作用，是这些疾病的潜在治疗靶点。国内外研究发现Lipocalin-2在乳腺癌、结肠直肠癌、口腔癌、肝癌、食管癌等多种恶性肿瘤中异常高表达，在肿瘤细胞的凋亡、黏附、浸润转移过程中扮演重要角色［5，6］。MMP-9是与恶性肿瘤转移和进展密切相关的锌依赖内肽酶，通过降解细胞外基质，下调黏附分子表达并上调血管内皮生长因子(VEGF)表达，在肿瘤新生血管形成、侵袭和转移中发挥重要作用。

Kubben等［7］研究发现，Lipocalin-2和MMP-9在胃癌组织高表达，Lipocalin-2可与MMP-9结合形成复合物，保护MMP-9免受降解，从而增加胃癌细胞的侵袭转移能力，患者生存率低，预后差。体外实验也证实，乳腺癌细胞株MDAMB-231中加入Lipocalin-2后，MMP-9降解被显著抑制，且随着Lipocalin-2浓度增加对MMP-9降解的抑制作用逐渐增加，采用抑制性单克隆抗体阻断乳腺癌细胞Lipocalin-2功能后细胞的侵袭和肺转移受到明显抑制［5］。因此，Lipocalin-2可能通过激活MMP-9并抑制其降解参与恶性肿瘤的侵袭转移过程，但Lipocalin-2、MMP-9在肺癌侵袭转移中的作用目前研究尚少。

本研究中我们首先采用Real-time PCR和Western blot检测Lipocalin-2在不同肺癌细胞株的表达，结果显示，Lipocalin-2 mRNA和蛋白在肺癌A549、NCIH661、NCI-H446细胞株中的表达水平均显著高于HBE细胞，差异有统计学意义(P＜0.05)。siRNALipocalin-2转染组Lipocalin-2 mRNA和蛋白表达水平与阴性对照组和空载体对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05); siRNA-Lipocalin-2转染组MMP-9 mRNA和蛋白表达水平与阴性对照组和空载体对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05); siRNA-Lipocalin-2转染组穿膜细胞数、平均迁移距离与阴性对照组和空载体对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。与Lipocalin-2蛋白在肺癌组织的表达［3］一致。以上结果均表明，Lipocalin-2与肺癌发生发展、远处转移密切相关。继而我们将构建的靶向Lipocalin-2基因的siRNA稳定转染人肺癌A549细胞株造成Lipocalin-2基因表达水平下降，观察Lipocalin-2基因沉默对MMP-9 mRNA和蛋白表达及细胞侵袭、迁移能力的影响。Real-time PCR和Western blot结果显示，RNA干扰技术成功造成Lipocalin-2基因沉默的同时也显著下调了MMP-9 mRNA与蛋白表达。Transwell小室是目前体外检测肿瘤细胞侵袭能力的常用方法，具有快速简便的优点。Transwell小室实验结果显示，siRNA-Lipocalin-2转染组穿膜细胞数较阴性对照组和空载体对照组显著降低，提示Lipocalin-2基因沉默能够明显降低细胞的侵袭能力。此外，细胞划痕实验结果显示，siRNA-Lipocalin-2转染组平均迁移距离较阴性对照组和空载体对照组显著减少，进一步证实Lipocalin-2基因沉默能够明显抑制人肺癌A549细胞的侵袭和迁移能力。

总之，人肺癌A549细胞Lipocalin-2表达增高，提示Lipocalin-2可能在肺癌细胞的侵袭和转移中发挥重要作用。采用RNA干扰技术靶向沉默人肺癌A549细胞Lipocalin-2基因减弱了细胞的侵袭、迁移能力，其作用机制可能通过下调MMP-9表达实现。本研究结果可能为肺癌的转基因治疗提供了新思路，最终实现延缓肺癌复发转移的治疗目的，Lipocalin-2/MMP-9基因有可能成为肺癌生物治疗的潜在新靶点。

参考文献

1Leng X，Ding T，Lin H，et al.Inhibition of lipocalin 2 impairs breast tumorigenesis and metastasis.Cancer Res，2009，69:8579-8584.

2钱海红.非小细胞肺癌化疗前后血清VEGF和MMP-9水平的对照观察.河北医药，2013，35:496-497.

3马小刚，杨晓光，赵峥.肺癌组织Lipocalin-2表达与肺癌预后的关系.河北医药，2014，36:1626-1628.

4Kjeldsen L，Johnsen AH，Sengelov H，et al.Isolation and primary structure of NGAL，a novel protein associated with human neutrophil gelatinase.J Biol Chem，1993，268:10425-10432.

5Leng X，Ding T，Lin H，et al.Inhibition of lipocalin 2 impairs breast tumorigenesis and metastasis.Cancer Res，2009，69:8579-8584.

6张秀峰.中性粒细胞明胶酶与相关载脂蛋白与结肠直肠肿瘤.外科理论与实践，2011，16:323-326.

7Kubben FJ，Sier CF，Hawinkels LJ，et al.Clinical evidence for a protective role of lipocalin-2 against MMP-9 autodegradation and the impact for gastric cancer.Eur J Cancer，2007，43:1869-1876.

Effects of Lipocalin-2 gene silencing on the expression of MMP-9 and the metastasis and invasion abilities of human

lung cancer A549 cells in vitro

MA Xiaogang，YANG Xiaoguang，REN Jing，et al.Department of Thoracic Surgery，Handan

Municipal Central Hospital，Hebei，Handan 056001，China

【Abstract】Objective To investigate the effects of gene silencing of Lipocalin-2 on the expression of MMP-9 and metastasis and invasion abilities of human lung cancer A549 cells in vitro.MethodsThe expression levels of Lipocalin-2 mRNA and protein in 3 kinds of human lung cancer cell lines (A549，NCI-H661，NCI-H446) and healthy human bronchial epithelial cells (HBE) were detected by Real-time PCR and Western Blot，respectively.The targeting Lipocalin-2 siRNA was established and transfected into A549 cells via lentivirus.Transfection efficiency and the expression levels of MMP-9 mRNA and protein were detected by Real-time PCR and Western Blot.Moreover the invasive ability and migration ability of A549 cells were detected by Transwell assay and scratch test，respectively.Results The expression levels of Lipocalin-2 mRNA and protein in A549，NCI-H661，NCI-H446 cells were significantly higher than those in HBE cells (P＜0.05)，furthermore，there were significant differences in the expression levels of Lipocalin-2 mRNA and protein between siRNA-Lipocalin-2 transfection group and negative control group as well as empty vector control group (P＜0.05).Besides there were significant differences in the cell number with membrane tresis and average migration distance between siRNA-Lipocalin-2 transfection group and negative control group as well as empty vector control group (P＜0.05).ConclusionLipocalin-2 gene silencing can decrease metastasis and invasion abilities of human lung cancer A549 cells in vitro through down-regulating the expression levels of MMP-9.

【Key words】lung cancer; Lipocalin-2; MMP-9; A549 cells; migration; invasion

【中图分类号】R 734.2

【文献标识码】A

【文章编号】1002－7386(2016) 02－0173－04

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2016.02.003

作者单位:056001河北省邯郸市中心医院胸外科

(收稿日期:2015－07－20)