殷 毅平 萍1.上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科，上海市男科学研究所（上海 200001）2.上海交通大学医学院附属仁济医院嘉定分院泌尿外科



减数分裂重组关键蛋白MMLLHH11结合蛋白的酵母双杂交筛选和鉴定

殷 毅1,2平 萍1*
1.上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科，上海市男科学研究所（上海 200001）
2.上海交通大学医学院附属仁济医院嘉定分院泌尿外科

摘要目的 探寻减数分裂关键重组蛋白MLH1在精子发生中的结合蛋白。方法 以MLH1为诱饵，通过酵母双杂交系统，在小鼠睾丸组织的cDNA文库中进行筛选，寻找MLH1的相互作用蛋白并通过GST pull-down和免疫共沉淀的方法进行验证。 结果 通过酵母双杂交的筛选，在小鼠睾丸中经四缺板筛出蛋白29个，包括已知的MLH3和PSM2等。通过GST Pull-down和免疫共沉淀验证了其中一个新的蛋白RHNO1与MLH1的结合。通过Real-time PCR检测发现RHNO1在睾丸中高表达，提示RHNO1在精子发生中具有重要功能。结论 酵母双杂交系统是寻找结合蛋白的有力手段，发现了新的MLH1结合蛋白RHNO1,可能参与了减数分裂同源重组。

关键词精子发生;减数分裂;重组蛋白质类

*通讯作者,E-mail:deer16@126.com

Key woorrddss spermatogenesis;meiosis;Recombinant Proteins

男性不育是影响人类健康的重大疾病，减数分裂中同源重组异常是睾丸生精功能障碍的重要原因[1]。同源重组标记物MLH1在精子发生中的减数分裂过程中具有重要作用，但作用机制仍不清楚。为了探索MLH1在减数分裂重组交换中的作用机制，我们通过酵母双杂交技术筛选小鼠睾丸cDNA文库，寻找MLH1在同源重组中的结合蛋白并进行筛选研究，为分析MLH1在减数分裂中同源重组的作用机制提供基础。

材料与方法

一、实验动物和细胞

实验中所用小鼠C57BL6J购自上海交通大学医学院，实验动物的使用得到上海交通大学医学院动物伦理委员会的批准。HEK293T细胞购自中国科学院细胞库。

二、质粒构建

用TRIzol（Invitrogen）提取小鼠睾丸及HEK293T细胞RNA，用PrimeScrip RT reagent Kit （Takara）逆转录成cDNA，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶（Takara）进行PCR，得到目的基因的CDS，经酶切后（EcoRI、SalI、BamHI，Takara），连接（DNA Ligation Kit，Takara）到相应载体上。MLH1（NM_026810.2）构建到pGBKT7（Clontech）和FLAG（p3xFLAG-myc-CMV-24，Sigma）载体上；mRHNO1（ENSMUSG00000048668）和hRHNO1（NM_001252499.2）构建到GFP （pEGFP-C1，Clontech）和GST（pGEX-5X-3，GE Healthcare）载体上。pGBKT7-MLH1上游引物：5’-ATATGAATTCATGGCGTTTGTAGC A G G A G T - 3’，下游引物：5’-ATATGGATCCTTTAACA-CCGCTCAAAGACT-3’；FLAG-MLH1上游引物：5’-ATATGAATTCTA TGGCGTTTGTAGCAGGAG3’，下游引物：5’- ATATGGATCCTTAACACCGCTCAAAGACT -T-3’； GFP/GST-mRHNO1上游引物：5’-TATAGAATTCGATGCCTCCCAAAAAGAGAC-3’，下游引物：5’- TATAGTCGACCTGTCAGA TCTTCACAAGGA-3’； GFP/GST-hRHNO1上游引物：5’- TATA G A AT T C G AT G C -C T C C C A G A A A A A A A C - 3’，下游引物：5’- T A T A G T C G -ACGGCAGTCAGCTTTTCACAAG-3’。

三、酵母双杂交

酵母双杂交实验按照Clontech公司提供的《Matchmaker GAL4 Two-Hybrid System 3 &Libraries User Manual》操作。酵母双杂交系统（Matchmake GAL4 Two-Hybrid System），小鼠睾丸组织cDNA文库（Mate &Plate Library - Mouse Testis）和酵母营养缺陷培养基购自Clontech。将pGBKT7-MLH1载体转化到AH109酵母中，经过毒性检测和自激活检测后，免疫印迹检测MLH1的蛋白表达。AH109菌株与小鼠睾丸cDNA文库采用高强度筛选条件，四缺培养板（SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp）加入2.5 mmol/L的3-AT（Sigma）。四缺板上的克隆经X-β-Gal（Sigma）验证后，PCR检测插入片段大小（引物为Matchmaker 3/5’ AD LD-Insert Screening Amplimer），并用HaeIII（Takara）酶切以去除重复克隆。提取酵母质粒，电击转化至DH5α大肠杆菌中，提取DH5α中的质粒，质粒送到Invitrogen公司测序，测序引物为Matchmaker 3/5’ AD LD-Insert Screening Amplimer。

四、GST pull-down 验证

将GST-mRHNO1和GST-hRHNO的质粒转化至BL-21大肠杆菌中，28℃ 1mM IPTG（Sigma）诱导表达5h，收菌后沉淀经PBS重悬、超声破碎，4℃ 12 000×g，离心15 min，取上清与Glutathione Sepharose 4B beads（G4B，GE healthcare）孵育，纯化GST融合蛋白；将FLAG-MLH1质粒用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染进入HEK293T细胞中，36h后收集细胞，PBS中重悬、超声破碎，4℃ 12 000×g，离心15 min，取上清与经G4B纯化的GST融合蛋白4℃孵育过夜。低速离心去上清后洗净凝珠，加入蛋白上样缓冲液，100℃煮10 min后，进行SDS-PAGE电泳、转膜。蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，硝酸纤维素膜进行免疫印迹，检测FLAGMLH1[2]。

五、免疫共沉淀

将FLAG-MLH1和GFP-mRHNO1或GFP-hRHNO1质粒在HEK293T细胞中共转染，36h后收集细胞，加入TNE裂解液（10 mmol/L Tris-HCl pH 7.5,150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA and 1% NP-40），冰上裂解2h，4℃12 000×g，离心15min，取上清，加到孵育了兔抗GFP（Abcam）的Protein G Sepharose 4 fast fl ow（GE healthcare）凝珠，4℃孵育过夜。低速离心去上清后洗净凝珠，加入蛋白上样缓冲液，100℃煮10min后，进行SDS-PAGE电泳后免疫印迹，检测FLAGMLH1[3]。

六、免疫印迹

碱裂解法提取酵母蛋白，或TNE裂解液提取HEK293T细胞过表达的FLAG-MLH1和GFP-mRHNO1、GFP-hRHNO1，SDS-PAGE电泳后电转到硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封闭，孵育鼠抗Myc（Proteintech）、鼠抗GFP（Clonetech）、鼠抗GAPDH（Proteintech）、鼠抗FLAG（Sigma），T B S T洗涤后孵育H R P偶联山羊抗兔/鼠I g G （Proteintech），洗涤后用ECL化学发光法经ImageQuant LAS 4000 mini（GE healthcare）检测目的蛋白。

七、Real-timee PPCCRR

用TRIzol提取小鼠各组织RNA，经NanoDrop 1000（Thermo Scientific）测定浓度，逆转录（PrimeScrip RT reagent Kit，Takara）为cDNA后，采用SYBR法（SYBR Premix Ex Taq II Kit，Takara），使用7500实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems）测定目的基因的表达水平。GAPDH上游引物：5-’TGTGTCCGTCGTGGATCTG-A-3’，下游引物：5’-TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG-3’；m R H N O 1上游引物：5’- TA AT T C AT C TC A C G C T G T T - 3’，下游引物：5’-CAAGGCTGTCAACCATTA-3’。

结 果

一、MMLLHH11在酵母中的表达、毒性及自激活检测

MLH1作为减数分裂重组交换中的标志物，在其中具有重要的作用，但是其具体的作用机制尚不是很清楚，还有待研究。酵母双杂交是筛选相互作用蛋白的有力工具，前期的研究利用了血液、乳腺及淋巴细胞的cDNA文库筛选MLH1的结合蛋白[4-6]。为了探讨MLH1在同源染色体重组交换中的作用机制，我们利用了小鼠睾丸的cDNA文库筛选MLH1的结合蛋白。将小鼠MLH1的CDS构建到pGBKT7载体上，转化到AH109菌株，免疫印迹检测了MLH1的表达（图 11AA）。MLH1对酵母的生长没有毒性（图 11BB和图 11CC），但自激活检测时发现其有轻微的自激活现象（图 11DD），而2.5 mM 3-AT的三缺板即能抑制其自激活（图 11EE--GG），而利用四缺板检测时，其完全没有克隆长出，表明高强度筛选条件比较适宜（图 11HH--JJ），而为了避免假阳性的出现，我们采用了2.5 mM 3-AT和四缺板的筛选条件（图 11II）。

图1 MLH11在AAHH110099菌株的表达及自激活检测

二、酵母双杂交克隆筛选

MLH1的AH109菌株与Y187的小鼠睾丸cDNA文库杂交之后，观测到了经典的三叶草(或米奇鼠)结构（图22AA）。挑选四缺板上长出来的克隆240个，经X-β-Gal验证，剔除了未变蓝的55个假阳性点（图 22BB），而两次PCR都未扩增的克隆，也将之去除49个克隆。将PCR产物按照大小分类，并用HaeIII酶切，将重复的克隆去除32个（图3），共得出克隆104个。

图2 酵母双杂交和X-β--GGaall检测结果

图3 HaeIIII 酶切去除重复克隆

三、酵母双杂交测序结果

酵母质粒转化至DH5α中，经6次电击转化，仍有30个克隆转化不成功，故共送样68个并测序成功。经在NCBI中序列比对并经去重，得到基因29个基因的mRNA。其中包括MLH1的已知结合蛋白MLH3和PMS2。经过文献调研、分析，选定了一个新的基因RAD9-HUS1-RAD1 interacting nuclear orphan 1 （RHNO1，ENSMUSG00000048668）。mRHNO1含有235个氨基酸，分子量为27Kd，保守性很高，人、小鼠、大鼠、牛、鸡和爪蟾的序列保守，其羧基端的保守性最高（图 44AA），小鼠和大鼠之间的同源性为89%，人和鼠之间的同源性为70%（图 44BB）。

图4 RHNO1保守性分析

四、MLH1和RHNO1相互作用的验证

通过外源表达、纯化GST融合蛋白mRHNO1和hRHNO1，利用GST pull-down技术沉淀HEK293T细胞中过表达的FLAG-MLH1，证明了RHNO1和MLH1的相互作用（图 55AA）；同时利用免疫共沉淀技术，在HEK293T细胞中同时过表达FLAG-MLH1和GFP-mRHNO1、GFP-hRHNO1，用GFP抗体沉淀相互作用蛋白，也验证了RHNO1和MLH1的相互作用（图 55BB）。

五、RHNO1的表达分析

通过Real-time PCR，分析了RHNO1在小鼠各组织中的表达水平，发现其在睾丸中的表达水平最高（图 6）。这一结果与Germ Online数据库中的芯片结果一致[7]。

图5 MLH1和RRHHNNOO11相互作用的验证

图6 Real-time PCR 检测mRRHHNNOO11在各组织中的表达

这些结果表明RHNO1参与了精子发生的调控，其与MLH1的相互作用，提示RHNO1参与了减数分裂中同源染色体重组过程的调控。

讨 论

减数分裂同源染色体重组交换是染色体正确分离和正常精子形成的关键，染色体分离异常可导致精子发生障碍。许多不育男性睾丸组织学研究表明减数分裂发生异常，同源染色体重组交换错误与男性不育的发生密切相关[8]。MLH1在精子发生中具有重要作用，MLH1的缺失导致精母细胞粗线期停滞，引起不育[9]。前期的研究发现，MLH1在粗线期联会复合体上呈点状分布，与重组节的分布类似；MLH1的缺失引起重组缺陷，但是联会正常。因此MLH1被用作同源重组和交叉的标志物[10]。但是，MLH1在同源重组和交叉中的具体分子作用机制尚不清楚。MLH1的功能之一可能是介导了MSH4-MSH5复合物从同源染色体上解离，促进交叉的完成[11]。其另一个功能可能是与MLH3形成MLH1-MHL3复合物，具有核酸内切酶（endonuclease）活性，可能参与了重组中间体的解离[12]。但是，还有更多的问题没有得到解答。

为了研究MLH1在同源重组中的具体的作用机制，我们通过酵母双杂交技术寻找MLH1在睾丸中的结合蛋白，发现了一个新的蛋白RHNO1与MLH1相互作用。通过分析RHNO1的序列，发现人、小鼠、大鼠、牛、鸡和爪蟾RHNO1的蛋白序列有较高的保守性，尤其是其羧基端（图 4）。通过GST pull-down和免疫共沉淀，验证了MLH1与RHNO1的相互作用（图 5），通过Real-time PCR和免疫印迹发现RHNO1在小鼠睾丸组织中表达水平最高（图 6），表明RHNO1在精子发生中具有重要功能。由于我们定制的抗体在组织学中的表现不佳，不能检测其在生精细胞中的定位，暂时还不能明确其在精子发生中具体环节中的作用。研究表明RHNO1能与Rad9-Rad1-Hus1 （9-1-1）复合体及ATR激活因子TopBP1独立结合，而9-1-1复合体通过募集RHNO1到DNA损伤位点，激活Chk1，启动DNA损伤修复[13]。并且在人的细胞中敲低RHNO1能够部分降级紫外线引起的ATR-Chk1信号通路的活性，但不影响9-1-1复合体与染色体的结合，也不影响9-1-1复合体与TopBP1的结合[14]。同时，RHNO1的变异体与遗传性乳腺癌的发生关系不大[15]。这些结果提示RHNO1的主要功能可能与DNA损伤修复的关系不是很大。由于RHNO1主要表达在睾丸中，并与MLH1相互作用，提示RHNO1可能与MLH1介导的染色体同源重组相关。

参考文献

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13 Cotta-Ramusino C,McDonald ER 3rd,Hurov K,et al.A DNA damage response screen identifi es RHINO,a 9-1-1 and TopBP1 interacting protein required for ATR signaling.Science 2011;332(6035):1313-1317

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（2015-11-18收稿）

Screening and verifi cation of proteins that interact with MLH1,the key protein in meiosis recombination,by yeast two hybrid screening

Yi Yin1,2,Ping Ping1*
1.Department of Urology,Renji Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai Adrology Institute,Shanghai 200001,China;
2.Department of Urology,Jiaotong Branch of Renji Hospital Affi liated to the Medicine School of Shanghai Jiaotong University
Corresponding author:Ping Ping,E-mail:deer16@126.com

AbstractObjective To screen proteins that interact with MLH1,the key protein in meiosis recombination in spermatogenesis.Metthhooddss Mouse testis cDNA library was screened by the bait of MLH1 using yeast two hybrid system to fi nd proteins interact with MLH1,and the interaction was validated by GST pull-down and co-immunoprecipitation.Resullttss Total of 29 interaction proteins were found on the plate of SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp by yeast two hybrid screening,including the known interaction proteins of MLH3 and PSM2.A new interaction protein was found which was named as RHNO1,and the interaction was confi rmed by GST pull-down and co-immunoprecipitation.The high expression level of RHNO1 in testis revealed by real-time PCR indicates that RHNO1 may have important function in spermatogenesis.Conclusion Yeast two hybrid system is an effective method to fi nd new interaction proteins,and we have identifi ed a new protein (called) RHNO1 interacted with MLH1,which may play roles in meiotic homologous recombination.

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.01.004

中图分类号R321.1