李俞池林首任罗满玲郭 焕, 3吴汉伟江智茂桂耀庭**. 北京大学深圳医院, 深圳市男性生殖与遗传重点实验室（深圳 58036）;2. 汕头大学医学院; 3. 广州医科大学; . 深圳市第二人民医院

·论 著·

睾丸特异性基因BC05162851628在小鼠中的表达及生物信息学分析*

李俞池1, 2林首任1罗满玲1, 2郭 焕1, 3吴汉伟4江智茂1桂耀庭1**
1. 北京大学深圳医院, 深圳市男性生殖与遗传重点实验室（深圳 518036）;
2. 汕头大学医学院; 3. 广州医科大学; 4. 深圳市第二人民医院

摘要目的 研究睾丸特异性基因BC051628在小鼠中的表达特征。方法 通过分析小鼠基因表达谱芯片，发现 BC051628基因特异性表达于睾丸组织。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、实时聚合酶链反应（Real-time PCR）、蛋白免疫印迹法（Western blot）及免疫组化等方法分析该基因在小鼠不同组织及睾丸不同发育阶段的表达特征。利用生物信息学软件对该基因进行相关生物信息学分析。结果 BC051628基因在小鼠各组织中呈现睾丸特异性表达并伴随明显年龄依耐性。免疫组化染色发现BC051628蛋白主要定位于精原细胞、精母细胞及圆形精子。生物信息学分析发现BC051628基因编码蛋白氨基酸序列在人和小鼠具有高度同源性，提示该基因在哺乳动物进化过程中十分保守。结论 BC051628属于睾丸特异性基因，可能在生精过程发挥重要作用。

关键词基因; 睾丸; 计算生物学; 精子发生

睾丸是人体重要的生殖器官，睾丸中精子正常发生是人类繁衍的基础。精子发生（spermatogenesis）是一个非常复杂且有序的过程，它涉及到多种睾丸特异性基因在不同时间和空间的先后表达及相互作用，例如：Cerm[1]，Dmc1[2]，Hist1h1t[3]，Cdc2[4]，np1[5]等。因此研究这些基因的表达特征及功能，对掌握精子发生的内在机制及阐明男性生精障碍具有重要作用[6]。

基因表达谱芯片作为基因表达信息的重要数据库，在基因识别、绘制基因表达图谱、寻找新基因等研究领域获得了广泛的应用[7]。目前美国国家生物信息中心（NCBI）的基因表达谱芯片数据库（GEO DataSets）已经拥有30余万条小鼠睾丸基因表达数据记录[8]，为寻找小鼠睾丸特异性新基因提供了基础。我们实验室通过对小鼠基因表达谱芯片数据库分析，发现 BC051628 基因特异性表达于睾丸。进而通过采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR） 及实时聚合酶链反应（Real-time PCR）等实验方法证实，BC051628属于睾丸特异性基因。经生物信息学分析，BC051628基因在哺乳动物进化过程中十分保守。该基因发现为研究精子发生提供了一个新的候选基因。

材料与方法

一、材料

总 RNA 抽提试剂 Trizol 购自 Invitrogen 公司。逆转录试剂盒购自日本Takara 生物公司。PCR 扩增引物由 Invitrogen 广州公司合成。Anti-BC05162 抗体购自Abcam。C57BL/6J 小鼠购自南京动物模式研究。实验经我院医学伦理委员会批准。

二、小鼠各组织及各发育阶段睾丸总RNARNA提取

取成年小鼠5只，分别提取各组织的总 RNA（睾丸、附睾、膀胱、肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、心脏、大脑）。分别取1周、2周、3周、4周、8周和6 个月小鼠睾丸组织，每个时间点的小鼠数量为5只，按照RNA 抽提试剂盒说明书抽提总 RNA。

三、RT-PCRT-PCR

用紫外分光光度仪对提取的总RNA 进行定量后，取1μg总RNA按照试剂盒说明书（ RR047A, akara, Dalian, Japan ）进行逆转录（ reverse ranscription，RT ）。将逆转录产物（ cDNA ）进行CR 反应。在20μL反应总体积加入：cDNA 1μL，CR Master Mix 10μL，正、反向引物（ 20 μmol ）共1.0μL，灭菌水8μL。PCR 扩增条件如下：98 ˚C预变性2 min，98 ˚C变性10 s，55 ˚C退火30 s，72 ˚C延伸30 s，共32个循环，72 ˚C延伸5 min，4 ˚C冷却30 min，反应结束后置4 ˚C保存。2.5 %琼脂糖电泳检测PCR产物大小。Gapdh 为内参对照，引物序列见（表 1）。

表1 基因引物信息

四、Real-time PCRe PCR

按照SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ PCR Kit说明书，以逆转录合成的cDNA 作为模版在Light Cycler480Ⅱ荧光定量PCR仪上进行Real-time PCR反应。 反应体系为：模版cDNA 1μL，SYBR premix Ex TaqTM Ⅱ PCR Mix 10μL，正、反向引物（20 μmol）共1.6μL，加RNase-free water 7.4μL至总体积20μL。反应条件为: 95 ˚C 30s，随后95 ˚C 5 s，55 ˚C 30 s，72 ˚C 15 s 共40个循环。数据处理及统计学分析， 以Gapdh作为内参进行标准化处理，采用ΔΔCT法分析数据[9]。

五、蛋白免疫印迹法（Western blot blot）

将提取好的成年小鼠各个组织蛋白使用BCA定量试剂盒定量到2 μg/μL，按比例加入5 × SDS上样缓冲液，100 ˚C加热10 min，制备SDS聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量20 μL，常规电泳、转膜、封闭，加入anti-BC051628兔多克隆抗体（ab84944，1:500稀释），4 ˚C过夜孵育抗兔二抗（ab6721，1:10 000稀释）室温孵育1h，TBST洗涤3次，ECL发光液处理后暗室内曝光胶片，于室温下自然风干，扫描仪扫描结果保存。

六、免疫组化

睾丸石蜡切片脱蜡后用0.25% 过氧化氢液处理15min，经山羊血清于37˚C处理30min, 加anti-BC051628兔多克隆抗体，后置于4˚C冰箱过夜，再加入生物素标记的二抗（SPTM试剂盒 ZYMED）在37˚C，60 min 后加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，孵育30 min，DAB显色约1min。以上各步间均用PBS 冲洗，阴性对照用PBS 替代一抗。

七、生物信息学分析

小鼠BC051628蛋白氨基酸序列来自（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）。蛋白理化性质分析使用（http://web.expasy.org/protparam/）。多序列同源性比较采用（http://www.ebi.ac.uk./Tools/msa/clustalw2/）。蛋白亚细胞定位采用（http://www.psort.org/）。

结 果

一、 BC05162851628 在成年小鼠各个不同组织中的RT-PCRT-PCR 结果分析

成年小鼠各个不同组织（ 睾丸、附睾、膀胱、肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、心脏、大脑，骨骼肌 ）RTPCR 结果（图 1）表明，BC051628基因特异性表达于小鼠睾丸组织；内参 Gapdh 在各个组织稳定表达。

图 1 BC05162851628 基因在成年C57BL/6JBL/6J小鼠各个不同组织中的RT-PCRT-PCR结果

二、BC05162851628 在成年小鼠各个不同组织中的Western blot blot结果分析

成年小鼠各个不同组织（睾丸、附睾、膀胱、肾脏、肝脏、脾脏、肺脏、心脏、大脑，骨骼肌）western blot 结果（图 2）表明，BC051628蛋白呈现睾丸特异性表达；内参GAPDH 在各个组织稳定表达。

图 2 BC051628蛋白在成年C57BBLL//66JJ小鼠各个不同组织中的Western bblloott结果

三、BC05162851628 在小鼠不同周龄睾丸组织中的RT RT 及 Real-time PCR PCR 结果分析

1周、2周、3周、4周、8周和6个月小鼠睾丸组织 RT (A) 及 Real-time PCR (B) 结果（图3）表明，小鼠BC051628 基因在出生后2周内睾丸组织中基本不表达，从出生后第2周开始出现持续性高表达，成年时表达量达到最高；内参 Gapdh在不同周龄小鼠睾丸均稳定表达。BC051628 基因在小鼠睾丸发育过程中成年龄依耐性表达，说明该基因与精子发生过程密切相关。

图 3 BC05162851628 基因在 C57BL/6JBL/6J 小鼠不同周龄睾丸组织中的 RT-PCRT-PCR

四、 BC05162851628蛋白在小鼠不同周龄睾丸组织中的免疫组化结果分析

1周、2周、3周、4周、8周和6个月小鼠睾丸组织免疫组化结果（图4）表明，小鼠BC051628 蛋白在出生后2周内睾丸组织中基本不表达，从出生后第三周开始出现持续性高表达；BC051628蛋白主要定位于精原细胞、精母细胞及圆形精子。

五、小鼠BC05162851628 基因生物信息学分析

BC051628 基因全长6742 bp, 定位于小鼠2号染色体 H4 区 ；有2种不同的转录本，其中转录本1（ ENSMUST00000050026 ）编码 326 个氨基酸（ENSMUSP00000066320 ）；小鼠BC051628蛋白有326 个氨基酸，理论相对分子质量为 37 kDa，理论等电点 PI 为6.27。BC051628 蛋白经生物学信息学分析定位于细胞核。人与小鼠 BC051628 蛋白同源性分析表示：该蛋白氨基酸序列呈高度相似性（图5），提示该基因在哺乳动物进化过程中十分保守。

图4 BC05511662288蛋白在 C57BL/6J 小鼠不同周龄睾丸组织中的免疫组化结果Bar = 50μm

图5 小鼠和人 BC05162851628蛋白同源性分析

讨 论

近年来男性不育的发病率呈现出上升趋势，然而引起男性不育的病因至今仍未完全明了，多种因素可导致男性不育，包括药物、内分泌、免疫、感染、创伤等。遗传缺陷和基因的改变与男性不育的发生密切相关[10]。精子发生过程中一些体细胞表达的结构基因静止，而一系列睾丸生精细胞特异的基因持续表达[11]。目前大部分睾丸生精细胞特异的基因的功能尚不清楚，这些基因与男性不育的关系仍有待阐明。

哺乳动物的精子发生是一个极其复杂的过程，在哺乳动物中精原细胞转变成精子需经历一系列复杂事件，包括：有丝分裂、减数分裂及细胞分化[12]。减数分裂在小鼠出生后第 11天开始，第15天粗线期精母细胞约占生精上皮细胞总数的1/3左右，第18天第一次减数分裂完成，第21天第二次减数分裂完成，即可在生精小管中见到圆形精子细胞[13]。在小鼠出生后的35～38d之间是其圆形精子向长形精子转化的变态过程。 本研究分析的BC051628基因在小鼠睾丸组织中特异性表达，其在2l d龄睾丸之前不表达，在28d 龄及6月龄小鼠睾丸中持续高表达。上述结果表明 BC051628 基因的表达与小鼠精子发生过程基本一致。

BC051628基因全长6742 bp，定位于小鼠2号染色体 H4区，编码326个氨基酸。BC051628只表达于小鼠睾丸组织，并呈现明显年龄依耐性，说明该基因与精子发生过程密切相关。BC051628蛋白在睾丸中主要定位于精原细胞、精母细胞及圆形精子。经生物信能息学分析发现BC051628蛋白主要定位于细胞核，其编码蛋白在小鼠与人中呈现高度同源性，提示该基因在哺乳动物进化过程中十分保守。

本实验采用RT-PCR及Western blot等方法第一次证明BC051628属于睾丸特异性基因。目前，确定BC051628基因的蛋白质表达特点及其功能正在我们实验室里进行。这些研究工作的顺利开展，将为解释BC051628在精子发生过程中确切功能提供实验证据。

参 考 文 献

1 Beissbarth T, Borisevich I, Horlein A, et al. Analysis of crem-dependent gene expression during mouse spermatogenesis. Mol Cell Endocrinol 2003; 212(1-2): 29-39

2 Yoshida K, Kondoh G, Matsuda Y, et al. The Mouse reca-like gene Dmc1 is required for homologous chromosome synapsis during meiosis. Mol Cell 1998; 1(5): 707-718

3 Nayernia K, Meinhardt A, Drabent B, et al. Synergistic effects of germ cell expressed genes on male fertility in mice. Cytogenet Genome Res 2003; 103(3-4): 314-320

4 Yu BZ, Song YT, Yu DH, et al. Expression and immunohistochemical localization of Cdc2 and P70s6k in different stages of mouse germ cells. Cell Biochem Funct 2006; 24(2): 113-117

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10 Dada R, Gupta NP, Kucheria K. Molecular screening for Yq microdeletion in men with idiopathic oligozoospermia and azoospermia. J Biosci 2003; 28(2): 163-168

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12 Abou-Haila A, Tulsiani DR. Mammalian sperm acrosome: formation, contents, and function. Arch Biochem Biophys 2000; 379(2): 173-182

13 Anawalt BD. Approach to male infertility and induction of spermatogenesis. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98(9): 3532-3542

（2014-10-24收稿）

**通讯作者, Tel: 0755-83923333-3320; E-mail: guiyaoting2007@aliyun.com

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.02.002

中图分类号R 349.6; R 698.2

*基金项目资助: 国家自然科学基金资助项目（31271244 和 31471344）; 深圳市科技计划重点项目（XB201104220045A 和 JCYJ20140415162543017）

Expression and bioinformation analysis of a testis-specific gene BC051628 in mice＊

Li Yuchi1, 2, Lin Shouren1, Luo Manling1,2, Guo Huan1,3, Wu Hanwei4, Jiang Zhimao1, Gui Yaoting1**
1. The Key Laboratory of Male Reproductive Medicine and Genetics, Peking University Shenzhen Hospital, Shenzhen, 518036, China; 2. Shantou University Medical College; 3. Guangzhou Medical University; 4. The Second People's Hospital of Shenzhen
Corresponding author: Gui Yaoting, Tel: 0755-83923333-3320; E-mail: guiyaoting2007@aliyun.com

AbstractObjective To identify the expression characteristic of BC051628 (cDNA sequence BC051628) gene in mice. Methodsthods A new testis-specifi c gene BC051628 was identifi ed in mice by gene expression profi le analysis. The expressions of BC051628 in different tissues and developmental stage of testes in mice were further validated by real-time PCR, western blot and immunohistochemistry. The related bioinformation analysis were done using bioinformatics software. Resultssults BC051628 were exclusively expressed in testes in an age-dependent manner. The protein of this gene was mainly expressed in spermatogonia, spermatocytes and round spermatids. Bioinformatics analysis showed that BC051628 protein amino acid sequences had a high degree of similarity between human and mice, which indicated that this gene was highly conserved in mammals. Conclusionusion BC051628 is a testis-specifi c gene, might play an important role in spermatogenesis.

Key wordsords genes; testis; computational biology; spermatogenesis