尹逊天　王　巍　朱玉峰　白　光

(辽宁医学院附属第一医院普外科，辽宁　锦州　121000)



枸杞多糖对人脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移及血管形成的影响

尹逊天王巍朱玉峰白光

(辽宁医学院附属第一医院普外科，辽宁锦州121000)

〔摘要〕目的观察枸杞多糖(LBP)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖、迁移能力及血管形成的影响。方法在HUVECs分别加入不同浓度的LBP后，应用噻唑蓝(MTT)和划痕实验方法检测对HUVECS增殖与迁移的影响。利用基质胶实验检测实验浓度LBP对血管形成作用的影响。结果①MTT 实验结果表明：随LBP浓度增加，抑制HUVECs增殖能力增强，同时应用甩片实验可推断LBP通过促进HUVECs凋亡而达到抑制细胞增长的作用；②划痕实验显示实验浓度LBP作用下HUVECs迁移距离较空白对照组具有统计学差异；③实验浓度LBP可明显抑制血管形成。结论LBP对HUVECs增殖迁移及血管生成能力具有明显抑制作用。

〔关键词〕枸杞多糖；人脐静脉血管内皮细胞；增殖；迁移；血管形成

肿瘤血管生成是所有实体肿瘤的共同特征，是实体肿瘤生长和转移必须依赖的病理学基础，与肿瘤的生长、侵袭转移关系极为密切。因此抗血管生成靶向治疗已经成为肿瘤治疗的重要策略，本文观察枸杞多糖(LBP)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)增殖和迁移作用的影响，并检测LBP对血管形成的影响。

1资料与方法

1.1一般资料2013年3月至2014年1月我院肿瘤中心实验室完成。HUVECs由我院肿瘤中心实验室提供，LBP含量35%，由上海康舟真菌多糖有限公司生产，胰蛋白酶〔含乙二胺四乙酸(EDTA)〕、二甲基亚砜(DMSO)由美国Sigma公司生产，优级胎牛血清由美国Gibco公司生产，DMEM高糖型培养基由美国 Hyclone公司生产，噻唑蓝(MTT)由美国Genview 公司生产。

1.2HUVECs培养方法由37℃体积分数为5%CO2孵育箱中取出T25培养瓶，倒置相差显微镜下见HUVECs贴壁生长，生长状态良好，平铺培养瓶底部，未见细胞重叠现象，当细胞铺满细胞瓶壁80%～90%时，出现生长抑制，进行细胞传代。具体如下：①将培养瓶内培养液倒掉，用5 ml移液枪将瓶内剩余培养液吸出，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2～3遍，动作轻柔，加入0.25%胰蛋白酶消化液3 ml，以胰酶铺满培养瓶底部为准，放回孵育箱中，消化1 min；倒置相差显微镜下可见细胞回缩、变圆，细胞间隙变宽，少数贴壁细胞悬浮，随后加入3 ml DMEM高糖培养液终止胰酶消化，同时用5 ml移液枪反复吹打瓶壁，倒置相差显微镜下见细胞均无贴壁，呈单个漂浮培养液；②将细胞悬液移入15 ml离心管中，1 200 r/min，离心3 min后，见离心管底部灰白色细胞沉积，用3 ml吸管吸弃上清液，加入3 ml DMEM高糖培养液后反复吹打成单细胞混悬液；③将3 ml细胞混合悬液分别置于3个T25培养瓶中，再将每个T25培养瓶内加入含10%胎牛血清的DMEM高糖溶液4 ml，放入37℃体积分数为5%CO2孵育箱中继续培养。

1.3细胞计数用10 μl移液枪抽取内皮细胞培养第2步中3 ml单细胞悬液用于技术，轻打入细胞计数板中，操作轻柔，勿产生气泡，然后置于倒置相差显微镜下计数，取平均值。计数操作重复两次。细胞数目：4象限细胞数总和/4×107/L。

1.4MTT法测定细胞增殖实验实验分为6组，即A～F组，LBP浓度依次为0、20、50、100、200、500 μg/ml，每组均设6个复孔，以减小误差。

1.5细胞甩片技术应用200 μg/ml LBP常规培养HUVECs 24 h，取处于对数期生长的HUVECs，通过上述细胞培养技术及细胞计数方法，利用D-PBS溶液配置HUVECs单细胞悬液，调整细胞浓度至2×105/ml，应用100 μl移液枪抽取单细胞悬液100 μl，加入甩片槽中，调整甩片离心机，1 200 r/min，离心3 min，取出细胞载玻片，利用吉姆萨染液覆盖细胞涂片，染色2 min，之后应用清水冲洗掉粉红色背景染色，放置于倒置相差显微镜下观察。

1.6划痕实验利用上述细胞培养技术及细胞计数方法，取对数生长期血管内皮细胞配制单细胞悬液，调整细胞个数为每孔1.5×105个，接种于12孔板，待细胞贴壁，生长成单细胞层时，用200 μl枪头于板孔底面中轴划一道划痕，同时进行划痕部位拍摄，设空白对照组及实验组，每组4个复孔，常规培养24 h。以划痕剩余面积测定LBP对HUVECs迁移能力影响。

1.7血管生成实验于实验前一天，将Matrigel基质胶(BD公司)放于4℃融化。灭菌100 μl枪头及96孔板冷藏备用。开始实验时，由冰箱中取出冷藏好的100 μl枪头及96孔板，首先分组，设空白对照组及实验组，每组4个复孔，目的为减少实验误差，然后将Matrigel基质胶加入96孔板(空白对照组及实验组)中，每孔50 μl，共8孔。在加入基质胶时应注意保持枪头垂直于孔板中间位置，其中Matrigel基质胶应一直保持放在冰上，避免凝固。铺胶完毕后，将含有Matrigel基质胶的96孔板放入37℃孵育中孵育30 min，使基质胶凝固。在此过程中，开始准备HUVECs悬液，通过利用上述细胞培养技术及细胞计数方法配置HUVECs单细胞悬液，并调整细胞浓度为2×106/ml。空白对照组为含10%胎牛血清DMEM高糖单细胞溶液，对照组为含LBP 200 μg/ml单细胞溶液，细胞密度相同，均为2×106/ml。从孵育箱中取出96孔板，可见基质胶凝固完好，无气泡产生，随后将实验组细胞悬液及空白对照组细胞悬液分别加入96孔板中，每孔100 μl，含HUVECs 20 000个。随后将96孔板放入37℃体积分数为5%CO2孵育箱中培养，每隔6 h记录实验结果，最终取24 h血管形成图片。

1.8实验溶液配置①配置LBP母液。首先利用电子天平取35%含量LBP 10 mg，称量精确到小数点后两位，将称取的红褐色LBP粉末轻倒入15 ml离心管中，随后加入10 ml D-PBS稀释，使LBP粉末充分溶解，置于离心机中，500 r/min，后于超净台下应用0.22 μm微孔滤菌膜滤过沉淀物质及细菌，此时母液含量为1 μg/ml，母液配置完成。配置LBP实验溶液，以500 μg/ml浓度为例，首先应用1 ml移液枪抽取母液1 ml置于2 ml Eppendorf管中，按1∶1加入10%胎牛血清DMEM高糖溶液1 ml，反复震荡混匀，做好标记后存放于4℃冰箱。20，50，100，200 μg/ml浓度依次按上述方法成比例配置。②配取MTT溶液。利用电子天平称取50 mg MTT，称量精确到小数点后两位，置于15 ml离心管中，加入D-PBS 10 ml,使其溶解，反复震荡混匀，后于超净台内应用0.22 μm微孔滤膜除菌，分装冻存于-20℃冰箱中贮存。③实验细胞培养。取处于对数生长期的HUVECs，利用上述细胞培养技术及细胞计数方法，配置单细胞悬液，调整细胞浓度为4×104/ml，接种于96孔培养板中，每孔100 μl(约含HUVECs 4 000个)，四周边孔应用D-PBS隔离，每孔100 μl，从而减少细胞趋向运动。放37℃体积分数为5%CO2孵育箱中常规培养6～9 h，使细胞完全附壁同步，备用。

1.9MTT法测定细胞吸光度值观察细胞贴壁良好后，将各实验组如前分组所示加入含不同浓度LBP培养基，空白对照组利用含10%胎牛血清DMEM高糖培养基代替。继续放入孵育箱中培养24 h，然后每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μl，37 ℃孵育4 h，然后吸弃各孔中上清液，加入DMSO 150 μl/孔，振荡混匀，室温放置10～15 min，使结晶充分溶解混匀，于全自动酶标仪570 nm测定各组吸光度值。

1.10统计学方法采用SPSS17.0软件进行t检验和单因素方差分析。

2结果

2.1各组MTT检测结果见图1。与A组(1.488±0.051)比较，C、D、E、F组对HUVECs生长抑制作用逐渐增强，吸收值分别为1.334±0.048、1.040±0.068、0.765±0.051、0.479±0.052(P<0.01)，B组为1.490±0.015。依据半数致死量(LD50)，现选取200 μg/ml作为实验浓度。

图1　MTT 法测定各组吸光度值(×100)

2.2各组相对剩余面积比较实验组与空白对照组相对剩余面积具有统计学差异(P<0.05)，见表2，图2。实验浓度LBP可抑制新生血管形成，见图3。

2.3细胞甩片技术大部分细胞萎缩、碎裂，部分细胞内可见凋亡小体形成，见图4。由此推断LBP很可能是通过促进细胞凋亡，缩短细胞生存周期而达到抑制血管内皮细胞生长作用。

图2　各组各时间点(×100)迁移面积

图3　各组24 h血管形成情况

组别0h(μm2)24h(μm2)相对比(%)空白对照组42.26±1.4813.45±1.2868.22±2.07实验组43.19±1.0325.65±1.5640.63±2.811)

与空白对照组比较：1)P<0.05

图4　HUVECs经实验浓度LBP作用后细胞内部结构变化(×200)

3讨论

中药多糖对于临床疾病的治疗与预防有着新的领域及影响，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、降血脂、保肝等多种功能,其中中药多糖的免疫调节活性及抗肿瘤作用倍受关注〔1〕,抗肿瘤作用的活性成分已成为目前抗肿瘤研究的热点〔2〕。到目前为止，已发现100多种中药中的多糖化合物具有免疫促进作用〔3〕。LBP为其中之一，由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等六种单糖组成〔4〕，具有提高机体免疫能力，抑制肿瘤细胞长，提高机体免疫力，增强机体内免疫细胞活性及其数量的作用〔5〕。目前LBP能够提高免疫力，增强免疫细胞杀伤能力已得到大量研究的证实，相关文献表明，LBP可与树突细胞(DC)表面存在的多糖受体结合〔6〕,活化的DC及其释放的活性因子可间接作用T细胞，使其活性功能提高〔7〕，使T细胞转变为杀伤型T细胞，从而提高T细胞杀伤能力〔8〕；通过上调HL-60细胞表面MICA的表达，能增强自然杀伤(NK)细胞的杀伤活性〔9〕，且与浓度呈正比；单独诱导淋巴细胞活化和增殖不明显。而与PHA协同作用后可使淋巴细胞明显增殖〔10〕；同时LBP还可直接作用于肿瘤细胞，通过直接破坏癌细胞的膜表面结构，使得肿瘤细胞无法进行正常的生命活动，降低肿瘤细胞膜的流动性〔11〕。

在肿瘤生长的微环境中不单纯只有肿瘤细胞的存在，其中还有着大量的炎性细胞及基质细胞〔12〕，血管内皮细胞为其中之一，其主要功能为参与肿瘤血管的生成，而新生血管的形成则与肿瘤生长及迁移有着密不可分的联系〔12〕。实体瘤的生长具有血管依赖性，当肿瘤间质血管生成后，肿瘤细胞会呈指数倍增长，转移的机会也随之增加〔13〕。本实验表明，200 μg/ml LBP对HUVECs的增殖及迁移具有明显的抑制作用，其机制很可能是缩短血管内皮细胞周期，促进其凋亡，从而达到抑制细胞增殖。同时血管内皮生长因子作为新生血管最为关键的刺激因子〔14〕，推测LBP能够降低其血清中含量〔15〕，从而达到对HUVECs形成新生血管明显的抑制作用。200 μg/ml LBP作用于机体正常基质细胞有无影响目前尚不明确，有待研究。

4参考文献

1李杰,张楚菁.中药多糖的免疫调节及抗肿瘤作用〔J〕.中国兽医杂志,2004;40(11):31-3.

2魏虎来,贾正平,赵怀顺,等.T-AK细胞和IL-2脂质体联合硒酸酯多糖抗白血病效应的研究〔J〕.中华微生物学和免疫学杂志,1998;18(3):410.

3吴晓忠,罗素琴,刘乐乐,等.中药多糖抗肿瘤作用的研究进展〔J〕.内蒙古医学院院报2009;31(1):81-3.

4王学宏,李明春.中药多糖的免疫及抗肿瘤作用研究进展〔J〕.浙江中西医结合杂志,2003;23(6):56-9.

5Tang Wai Man,Chan Enoch,Kwok Chingyee,etal.A review of the anticancer and immunomodulatory effects of Lycium barbarum fruit〔J〕.Inflammopharmacology,2012(20):307-14.

6Goldman R.Characteristics of the glucan receptor of murine macrophages〔J〕.Exp Cell Res,1988;17(4):481.

7王晓华,单铁英,侯永超,等.枸杞多糖增强效应T细胞增殖和杀瘤活性机制的研究〔J〕.中国实验诊断学,2015;14(5):699-701.

8郝习.枸杞多糖对树突状细胞的成熟及免疫学功能的影响〔J〕.中医研究,2010;23(11):24-7．

9张连生,宋佳.枸杞多糖对NK细胞杀伤活性的影响〔J〕.健康必读杂志，2013;3(3):343.

10单铁英,关华苏,安英,等.枸杞多糖对人外周血淋巴细胞免疫调节功能的影响〔J〕.实用医学杂志,2010;26(3):361-3.

11王婉钰,季宇彬,毕明刚.天然药物多聚糖类抗肿瘤研究进展〔J〕.黑龙江医药,2013;26(2):200-2.

12Daniela FQ,Johanna AJ.Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis〔J〕.Nature Med,2013;19(13):1423-37.

13Wangatsuma S,Konno R,Sato S.Tumor angiogenesis,hepatocyte growth factor and c-Met expression in endometrial carcinoma〔J〕.Cancer,1998;82(3):520.

14Weider N.Current methods for measuring intratumoral microvessel density within breast carcinoma and other solid tumors〔J〕.Breast Cancer Res Treat,1995;36(2):169.

15何彦丽,应逸,罗荣敬,等.枸杞多糖对荷瘤小鼠免疫抑制因子VEGF、TGF-β1水平的影响〔J〕.中药新药与临床药理,2005;16(3):172-4.

〔2014-11-23修回〕

(编辑苑云杰)

〔中图分类号〕R3

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)08-1819-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.013

通讯作者：白光(1959-)，男，主任医师，主要从事普外科微创肝胆病研究。

基金项目：吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金(No.320.6750.1281)；运动系统疾病转化医学研究中心及协同研究网络建设项目(No.2013225305)

第一作者：尹逊天(1989-)，男，硕士在读，主要从事肝胆疾病研究。