马　俊　顾　勇　鲁建军　缪　蓉　罗红鹤

(中山大学附属第一医院胸外科，广东　广州　510080)



奈达铂耐药食管鳞癌患者血清双向电泳联合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术的蛋白筛选

马俊顾勇鲁建军缪蓉1罗红鹤

(中山大学附属第一医院胸外科，广东广州510080)

〔摘要〕目的探讨奈达铂耐药食管鳞癌患者及奈达铂敏感患者的血清蛋白表达谱的差异性及食管鳞癌奈达铂耐药的相关血清蛋白。方法采用固相pH梯度双向凝胶电泳分离奈达铂敏感及奈达铂耐药患者的血清蛋白样本共40例，建立双向凝胶电泳(2-DE)图谱，再应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术及数据库鉴定部分差异蛋白质。结果采用2-DE技术成功获得分辨率高和重复性好的蛋白表达图谱，凝胶图像软件分析后获得差异≥1.5倍以上的蛋白质共68个，经质谱分析鉴定出8种蛋白，其中表达增高的有谷胱甘肽转硫酶(GST)P1、乳酸脱氢酶(LDH)-B、Sox-2、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)-1和基质金属蛋白酶(MMP)-7，表达降低的有E-钙黏蛋白(E-cadherin)、激活素结合蛋白(FS)和磷酸甘油酸激酶(PGK)1。结论应用2-DE技术分离奈达铂耐药食管鳞癌患者及奈达铂敏感患者的血清蛋白表达谱，并通过MALDI-TOF-MS技术鉴定出与食管鳞癌奈达铂耐药相关的蛋白，为食管鳞癌耐药相关标志物的筛选提供了新的技术方法及候选分子。

〔关键词〕双向凝胶电泳；基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱；食管鳞癌；耐药；奈达铂

奈达铂是临床常用的一种化疗药物，也是治疗食管鳞癌的一线用药，并且具有良好的临床应用效果。然而，食管鳞癌奈达铂耐药是一种普遍发生的获得性耐药，这一问题严重限制了奈达铂的抗癌疗效〔1〕。本研究拟通过收集奈达铂耐药食管鳞癌患者及奈达铂敏感患者的血清蛋白，采用双向凝胶电泳(2-DE)技术分离、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术及生物信息学进行分析鉴定，旨在寻找食管鳞癌奈达铂耐药相关蛋白标志物。

1材料和方法

1.1临床样本按照实体瘤的疗效评价标准(RECIST )〔2〕，共采集食管鳞癌患者血清样本40例，分别为20例接受奈达铂为基础的化疗后疾病进展(PD)及20例部分缓解(PR)的食管鳞癌患者，并以治疗后PR的20例患者作为对照，每组的3个样本混合提取蛋白，且每组样本各重复检测3次。两组患者的年龄、性别、肿瘤部位、病理类型、分化程度、临床分期和功能状况评分量表(KPS)评分等均无明显差异，具有可比性。

1.2试剂及仪器设备血清去除高分度蛋白：血清去高分度蛋白试剂盒ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit (Sigma，美国)。一向等点聚焦：超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，LTD JY96-Ⅱn)；分光光度计(上海光谱仪器有限公司Spectrum SHANHAI 765Pc)；冷冻离心机(珠海黑马医学仪器有限公司，LTD Hema TGL-18R)；水化盘immobile drystrip rewelling tray(GE，美国)；等电聚焦仪(GE ETTAN IPGPHOR3)。二向十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)：电泳槽(GE ETTAN DALTsix)。染色：扫描仪(UMAX Powerlook 1100)。图像分析：ImageMaster 2D platinum 5.0(GE，美国)。质谱前处理：真空干燥机(上海一恒科学仪器有限公司DZF-6020)；钢靶(ABI，美国)；羟基肉桂酸(HCCA，基质，ABI，美国)。质谱检测：Ultraflex Ⅲ TOF/TOF质谱仪(德国)。数据库检索：flexAnalysis(德国)；BioTools(德国)。

1.3血清蛋白制备吸取400 μl树脂匀浆于2.0 ml带滤柱离心管中，10 000 r/min离心10 min，去掉保存液。加入400 μl平衡液，10 000 r/min离心10 min，洗涤树脂，重复操作一次。缓慢滴加80 μl血清样本于树脂上，吸附10 min，10 000 r/min离心10 min，将收集到的样本再次滴加至树脂，再吸附10 min，10 000 r/min离心10 min，再加入100 μl平衡液洗涤树脂，10 000 r/min离心10 min，合并滤液后加入4倍体积丙酮，-20℃沉淀过夜。将沉淀得到的蛋白4℃，12 000 r/min离心20 min，去掉上清，晾干，-80℃保存备用。在干燥后的蛋白质团块中加入200 μl水化液(RB)，用枪头将蛋白质团块戳小后反复吹打直至蛋白质充分分散。超声助溶，80 W，0.8 s开，0.8 s关，超声4下后放于冰上冷却，再重复1次，超声后4℃，12 000 r/min离心20 min，吸出上清液，转移至新的EP管中。取5、10、15、20、25、30、35 μg的胎牛血清(BSA)制作标准曲线，样品一般取2～3 μl，双复管测定。每支管加入1 ml Bradford进行染色，涡旋振荡20 s，使其充分混匀后即可测定吸光值，测定时两个样品之间的操作间隔也应该是20 s左右。打入液体时要均匀，避免产生气泡。定量分两次进行，第一次为初步定量，计算得到各样品的浓度后，将所有样品浓度尽量调至比较接近，再进行第二次定量，为了保证定量的准确性，每次定量都需制作标准曲线。

1.4固相pH梯度双向凝胶电泳根据定量所得的数据吸取相应量的蛋白质，分析胶(银染)的上样量为银染120 μg，质谱胶(考染)的上样量为1 200 μg。上样液的成分为：相应量的蛋白质、1%二硫苏糖醇(DTT)、1%固体梯度胶条缓冲液(IPG Buffer)、1×溴酚蓝(BPB)、RB至460 μl。取出水化盘，调节水平备用。从冰箱取出干胶条室温下复温10 min。吸取离心后的样品上清液加到水化盘的槽中，将样本溶液均匀地加入槽底，加样长约22 cm。取出胶条，使支持膜朝操作者，从酸性端(有字端)开始，轻轻撕下覆盖膜，胶面朝下，酸性端朝顶端将胶条放入水化盘的槽中，操作过程要避免产生气泡。放好胶条后再加入1.2 ml覆盖油于支持膜上保湿，调节室内温度为20℃，让胶条泡胀过夜(10～12 h)，记录下胶条的号码。开机预冷，取出电极板，在等电聚焦盘中加入覆盖油(每条泳道加入6 ml)。取出胶条并吸干胶条上的覆盖油(覆盖油中可能有未被吸进凝胶中的样液)，胶面朝上将胶条放入等电聚焦盘中。剪好纸垫片，每个垫片加入75 μl Milli Q水进行润湿，将纸垫片放胶面的两端，边缘与胶面边缘对齐，装上电极板，选择胶条数量后便可开始运行程序。用上槽液配置0.8%的低熔点琼脂糖40 ml，1.5%的普通琼脂糖80 ml，烧熔后放于泡沫盒中保温备用。倒掉玻璃板胶面上的液体，残留的液体用滤纸片吸干，吸取低熔琼脂糖封住整个胶面。迅速从平衡管中取出胶条，在装上槽液的量筒中稍微涮洗一下，将胶条放入玻璃板中，酸性端朝左放置，用尺子把胶条压到二向胶胶面处，使胶条下端紧密接触二向胶胶面，注意不要让胶条下端困住气泡。依次放好胶条后将玻璃板装入下槽中，装玻璃板时可倾斜放入，不让玻璃板下端困住气泡。装好玻璃板后装上槽，然后在槽与玻璃板的缝隙处加入普通琼脂糖封住缝隙防止垂直方向上漏电。在上槽中轻轻地加入上槽液至最大刻度处，用上槽液稀释一倍配置成下槽液后，加入到下槽中直到上下槽液面相平，盖上盖子，接上电极后开始电泳。当BPB跑出二向胶以后可停止电泳。二向电泳的程序为：S1 2 W/gel 45 min；S2 17 W/gel直到溴酚蓝跑到底，约4.5 h。染色后在扫描前先把扫描仪擦干净，在玻璃上喷上一些水，再将凝胶转移到扫描仪上，将切了角的一端放在左下角位置，保证每张胶扫描的方向相同，扫描模式为256灰阶透视扫描，分辨率为200 dpi。对于考染的质谱胶，需在扫描仪的玻璃上垫一张洗干净的玻璃板，再将胶放在玻璃板上扫描，保证胶面的干净，以免质谱鉴定时引入污染物。扫描完的凝胶用保鲜膜包好后置于4℃保存。图像分析软件为ImageMaster 2D platinum 5.0。

1.5质谱检测和分析准备好相应数量的0.6 ml EP管，做好标记备用。取一块棉花用75%乙醇润湿后擦干净针备用。从4℃冰箱中拿出胶，对着打印图挖出相应的点，挖点时用针在相应点的边缘划一圈，将胶粒挑到EP管中。每挖出一个点就将把针头在MilliQ水中涮洗一下，接着挖下一个点。挖完点后将胶包好置于4℃保存，将挖出的点放入超净工作台中准备处理，并对应点的编号输入电脑。酶切后取相应数量的0.2 ml EP管，做好标记备用。取出酶切完的胶粒，在超声清洗机中超声处理15 min(超声处理有助于肽段从胶粒中溶解至覆盖液里)。吸出覆盖液至对应的0.2 ml EP管中，每吸一管换一次枪头，用完的枪头不要丢掉，放回枪头盒中的对应位置(下一步仍需用到这些枪头)。在EP管中加入60 μl抽提液对胶粒进行脱水，震荡10 min，吸出抽提液至对应的0.2 ml EP管中。真空干燥，直至EP管中液体完全挥发为止，合上管盖，-20℃保存。抽干的样品每管加入1.5 μl的重溶液，震荡1 min，再吸取管底的重溶液在管壁上涮几次，将管壁上的肽段充分溶解，再将管底的重溶液反复吹打6～7次。换上新的枪头，吸取0.8 μl点在钢靶的小孔内，点样时枪头不能碰到钢靶，先悬空将液滴挤出，悬挂在枪头尖，再轻轻沾到小孔内，将钢靶放在干净的地方风干。等到小孔内液滴完全干燥后，再把剩下的重溶液点到相同的小孔内，反复操作，直到所有样本溶液全部点到小孔上。最后一次点样后，当液滴挥发到原体积的1/3左右时，加入0.5 μl基质在样品上，等到完全干燥后即可送入质谱仪检测。利用德国布鲁克Ultraflex Ⅲ TOF/TOF质谱仪进行质谱分析。UV波长为355 nm，重复速率为200 Hz，加速电压为20 000 V，最优质量分辨率为1 500 D。扫描质量范围为700～3 200 D，收集信号。胰酶自切峰为内标校正质谱仪。所有实验样品的质谱图均以用默认模式获得。数据库检索：利用软件flexAnalysis过滤基线峰、识别信号峰。利用BioTools软件搜索NCBI数据库，寻找匹配的相关蛋白质，同时查询其功能，来明确鉴定的蛋白质为何种蛋白质。

2结果

2.1双向电泳图谱及差异斑点分析奈达铂耐药和对照的奈达铂敏感食道癌患者两组样本间蛋白质点数无明显差别，且相互间水平等电聚焦和垂直电泳方向位置偏差无明显差别，匹配率达86.9%，以示对应两样本间蛋白质斑点在位置上具有良好重复性和可比性，提示已成功建立食道癌奈达铂耐药和敏感的血清蛋白2-DE图谱，见图1，图2。按照差异蛋白质点数的判断标准，两组样本比较后筛选出差异倍数≥1.5倍的蛋白质点为差异斑点。以奈达铂敏感患者血清样本作为对照，上调的斑点有42个，编号为A，下调的斑点有26个，编号为B。差异蛋白质斑点的出现可能与食道癌患者的奈达铂耐药特性相关。

2.2斑点筛选及质谱分析结果从68个差异斑点中筛选出8个分辨清楚的斑点进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定。对质谱分析所得肽片与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽片进行比对，从而判别所测蛋白。本研究初步鉴定出8个差异蛋白质，即谷胱甘肽转硫酶(GST)P1、乳酸脱氢酶(LDH)-B、Sox-2、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)-1和基质金属蛋白酶(MMP)-7表达明显增高，而E-钙黏蛋白(E-cadherin)、激活素结合蛋白(FS)和磷酸甘油酸激酶(PGK)1表达缺失时，可能有利于食道癌患者形成奈达铂耐药性。

图1　奈达铂耐药食道癌患者血清样本的血清原始双向电泳图谱

图2　奈达铂敏感食道癌患者血清样本的血清原始双向电泳图谱

3讨论

奈达铂作为治疗食道癌的一线用药，广泛用于术前或术后食道癌病人，具有良好的临床疗效，但是其奈达铂耐药是一种普遍发生的获得性耐药〔1〕。不同临床个体间在耐药上的差异常常可体现在患者机体中总蛋白谱表达的差异上，而血清总蛋白由于其有较易的获取途径，具有明显临床检测优势，同时蛋白质组学方法为研究耐药机制与血清蛋白间的潜在关系提供了良好的技术平台。在本研究鉴定出的8个蛋白质中，GSTP1是研究较多的一种耐药相关的关键性蛋白，它是肿瘤细胞及其组织中最常见的同工酶之一，其过度表达有助于增强烷化剂等亲电性化疗药物的代谢，使机体产生耐药性〔3〕。再者，LDH-B〔4〕和PGK1〔5〕在以往的肿瘤耐药相关文献中已有报道。此外，本研究还发现细胞黏附分子E-cadherin〔6〕、癌细胞分泌蛋白IGFBP-1〔7〕和外分泌酶MMP-7〔8〕有不同程度的表达增加，这提示了由上皮细胞钙黏蛋白介导的细胞黏附作用机制在食道癌奈达铂耐药方面可能具有显著作用，而与肿瘤微环境相关的如癌细胞分泌蛋白IGFBP-1、细胞外基质分泌酶类MMP-7等也可能会影响奈达铂疗效。激活素结合蛋白(FS)主要与激活素结合，抑制其生物活性，在激活素结合蛋白低表达的患者中，机体可能通过解放更多的激活素对细胞增殖起正向作用，进而可能促进了食道癌奈达铂耐药的产生〔9〕。

本研究发现表达上调的Sox2基因是一种干细胞标志基因，其表达调控具高敏感性，也被用于与干细胞其他表面标志一起鉴定干细胞亚群，已有研究证实Sox2异常表达与结直肠癌和乳腺癌等密切相关，提示了肿瘤干性与食道癌奈达铂耐药的潜在关系，但尚待进一步研究证明。

4参考文献

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〔2015-07-10修回〕

(编辑袁左鸣)

〔中图分类号〕R73

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)08-1825-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.015

1中山大学附属第一医院手术室

第一作者：马俊(1978-)，男，主治医师，博士，主要从事普胸外科的研究。