杜　斌　阿米娜　陈俊良　陈　炜　庞庆丰

(江南大学无锡医学院,江苏　无锡　214122)



肝素对溺水小鼠脑损伤的保护作用

杜斌阿米娜陈俊良陈炜1庞庆丰

(江南大学无锡医学院,江苏无锡214122)

〔摘要〕目的观察肝素对溺水小鼠脑损伤的保护作用。方法选用雄性ICR小鼠，随机分为正常组，模型组，肝素组。小鼠溺死模型建立成功后，将小鼠断头处死，取全脑。作病理切片，观察各组脑组织切片HE染色组织形态学改变。测定脑组织中脂质氧化终产物丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶(MPO)活力，检测超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果与模型组相比，肝素组脑组织HE染色显示神经元清晰有所改善。与正常组比较，模型组脑组织 MPO活力、MDA含量增高，SOD活性低(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，肝素组脑组织中的MPO活力、MDA含量降低，SOD活性增高(P<0.01)。结论肝素对溺水引起脑氧化损伤有明显的保护作用，可能与其抗氧化损伤有关。

〔关键词〕肝素；溺水；脑损伤

肝素是临床常用的抗凝药物〔1〕。近年来研究发现，肝素除具有抗凝活性外，具有潜在的抗炎活性〔2〕。本实验拟观察肝素对溺死模型小鼠脑组织病理形态学及炎症等指标的影响，探讨肝素对溺死模型脑组织的保护作用及机制。

1材料与方法

1.1实验动物ICR 小鼠45 只，SPF 级，体质量(20±2)g，上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(合格证编号2007000564424)，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。

1.2仪器与试剂RM2135石蜡切片机(德国徕卡微系统有限公司)；80i正置荧光显微镜(日本尼康公司)；U410超低温冰箱(德国艾本德有限公司)；TG16A-WS台式离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；TS-8型漩涡混匀器(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司)；DK-8B型电热恒温水浴槽(上海精宏实验设备有限公司)；ME204E电子天平〔梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司〕；ELX800全自动酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)；5804R多功能台式离心机(德国艾本德有限公司)。丙二醛(MDA)(批号20141202)、超氧化物歧化酶(SOD)(20141201)试剂盒，髓过氧化物酶(MPO)(批号20141128)、 考马斯亮蓝(批号20150109)试剂盒(南京建成生物工程研究所)，肝素注射液(批号1406112)，其他试剂为国产分析纯。水源为太湖水，常温。

1.3实验方法参考马艳艳等〔3〕方法，并加以改进，建立小鼠溺亡模型。将实验小鼠随机分为正常组、溺亡组、肝素组，每组15只。实验前1 d小鼠禁食，自由饮水。肝素组在溺亡前30 min腹腔注射肝素〔4〕。将小鼠放入1个内壁光滑的50 ml离心管内(要求离心管两端有孔，将小鼠放置于管内并充满水，此步骤在充满水的桶内操作，水面高度与离心管上缘距离为10 cm)，让其自由游泳并仔细观察，其第1次呛水时按秒表计时，直至小鼠溺死。溺死后将小鼠完全从水中取出，建立小鼠溺亡模型。小鼠溺死指征：口唇黏膜苍白明显，躯干强直，四肢无游泳动作，头部几乎不能浮出水面，随后身体逐渐下沉至容器底部，抓取时无任何反抗动作。溺亡9 min后，取下小鼠脑组织。正常组小鼠直接取下脑组织。

1.4病理学检测将小鼠脑组织置于10%中性甲醛固定液中固定24 h,石蜡包埋，4 μm切片，HE染色，镜下观察。

1.5脑组织氧化指标测定取脑组织匀浆(脑组织∶生理盐 水=1∶10)，严格按照试剂盒说明书检测MDA、SOD、MPO含量及活性。

1.6统计学处理采用 SPSS11.5软件行单因素方差分析。

2结果

2.1脑组织形态学变化正常组脑组织结构完整、 神经元清晰；模型组脑水肿范围累及灰质和白质，神经元缺失或退变。血管扩张充血；肝素组神经元清晰有所改善、数目较模型组增加，见图1。

2.2肝素对溺死小鼠脑组织SOD活性、MDA 含量、MPO活力的影响与正常组比较，模型组脑组织 MPO活力、MDA含量增高，SOD活性降低(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，肝素组脑组织中的MPO活性、MDA含量降低，SOD活性增高(P<0.01)。见表1。

图1　各组小鼠脑组织形态学变化(HE,×400)

组别SOD(U/mgprot)MDA(nmol/mgprot)MPO(U/g)正常组180.4±11.19.1±0.40.22±0.03模型组154.6±9.31)13.8±0.62)0.65±0.082)肝素组166.1±5.31)2)12.1±0.52)0.46±0.092)

与模型组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

3讨论

溺水会导致急性呼吸系统损伤、电解质紊乱、肾衰竭、脑水肿、心力衰竭、溶血等损伤，最后甚至会导致多脏器功能不全综合征(MODS)〔5〕。有研究表明，肝素可以通过抑制免疫刺激或非免疫刺激诱导的肥大细胞活化、抑制白细胞黏附于血管内皮细胞、抑制细胞凋亡途径发挥其抗炎作用〔6～9〕。MDA含量间接反映机体细胞受自由基攻击的严重程度，因此，MDA被认为是反映机体氧化损伤最具代表性的指标之一。SOD是最先与活性氧自由基作用的酶，是机体抗氧化防御的第一道防线〔9,10〕。MPO通过产生自由基和多种具有氧化活性的物质，促进斑块形成和增加其不稳定性〔11〕。本实验结果表明，肝素具有不同程度的抗氧化应激作用。从脑组织形态学观察，肝素组小鼠在溺亡后脑组织损伤有所减轻，说明肝素的抗凝、抗炎作用对脑组织作用明显。脑代谢旺盛，是极易受损伤的组织，肝素对其损伤有一定的保护作用，其作用机制尚有待于深入的研究。

4参考文献

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3马艳艳，刘昕，李玉湘.溺水大鼠动物模型的建立及观察〔J〕.郑州大学学报(医学版),2008;43(2):359-62.

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11包金,单洪丽,孙璐璐,等.双向侧流免疫MPO参考区间的建立及MPO对AMI的临床价值探讨〔J〕.山东医药,2014;54(41):14-7.

〔2015-12-13修回〕

(编辑李相军)

Effects of Heparin on brain injury of mice of water drowning

DU Bin,A Mi-Na,CHEN Jun-Liang,et al.

Wuxi Medicine School of Jiangnan University,Wuxi 214122,Jiangsu,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect of Heparin on brain injury in mice challenged water drowning.MethodsICR male mice were randomly divided into normal,model,Heparin groups.After 9 min,the level of superoxide dismutase(SOD),malondialdehyde(MDA)and myeloperoxidase(MPO)were measured,the pathologic changes of the brain tissue sections were observed under microscope with HE staining.ResultsCompared with model group,clear improvement and the increasing number of nerve cell in Heparin group.Compared with normal group,the level of MDA and MPO in the brain tissue were increased,the level of SOD in the brain tissue was decreased in model group(P<0.05，P<0.01).Compared with model group,the level of MDA and MPO in the brain tissue were decreased,the level of SOD in the brain tissue was increased in Heparin group (P<0.01).ConclusionsHeparin has protective effect on brain oxidative damage induced by water drowning,which might be related to its antioxidation ability.

【Key words】Heparin;Drowning;Brain injury

〔中图分类号〕R965.1

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)08-1811-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.08.009

通讯作者：庞庆丰(1972-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事脏器保护研究。

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81270126)

1无锡市第三人民医院急救中心

第一作者：杜斌(1983-)，男，实验师，主要从事药理学及解剖学实验研究。