(第四军医大学唐都医院中心实验室,陕西西安 710038)



·论著·

Stathmin基因毕赤酵母表达体系的构建及鉴定*

(第四军医大学唐都医院中心实验室,陕西西安 710038)

摘要:目的构建Stathmin基因毕赤酵母表达体系，并对表达产物进行纯化和鉴定，为Stathmin相互作用蛋白的进一步研究提供实验基础。方法通过PCR方法从SKBR3乳腺癌细胞中扩增出人Stathmin基因片段，克隆入毕赤酵母表达载体pPIC3.5K，构建重组载体pPIC3.5K-Stathmin，转化GS115工程菌，经含基因素(G418)的酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基筛选出阳性克隆。用0.5%甲醇诱导表达，并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western Blotting鉴定表达产物。结果DNA测序结果表明，所获基因片段与Stathmin基因序列一致。在含有G418 600 μg/mL的YPD培养基上筛选出的pPIC 3.5K-Stathmin转化子，经PCR鉴定为阳性克隆。SDS-PAGE可见约 37×103处有目的条带表达，经Western Blotting鉴定，此条带为Stathmin蛋白。结论成功构建了Stathmin酵母表达载体，并在毕赤酵母中表达成功，为Stathmin相互作用蛋白研究以及生物治疗药物的制备奠定了基础。

关键词:基因；毕赤酵母表达体系；鉴定

Stathmin是一种高度保守的细胞质磷蛋白，通过其磷酸化和去磷酸化高效调节细胞的增殖和分化[1]。国内外研究均表明Stathmin蛋白与多种肿瘤的发生发展密切相关[2-4]，并与肿瘤组织学分级、病情进展以及预后相关[5]。Stathmin被认为是潜在的肿瘤标志物和肿瘤治疗新靶点[6]。为进一步深入探讨以Stathmin为靶点的应用研究，Stathmin表达体系的建立至关重要，而原核表达体系虽然周期短、表达产量高，但目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低，不能满足进一步研究的需要。所以研究者构建了Stathmin毕赤酵母真核表达体系，纯化His-Stathmin蛋白，为发现新的Stathmin拮抗蛋白和新的肿瘤生物治疗药物奠定基础。

1材料与方法

1.1材料pPIC3.5K载体和pichia host strain购自Invitrogen公司。E.coliJM109为本实验室保存。限制性内切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ、Tap DNA聚合酶、T4DNA连接酶，均购自Takara公司。Anti-His抗体购自中衫金桥公司，Anti-Stathmin抗体购自cell singaling公司，其他常规试剂为本实验室保存。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成；引物序列如下：Stathmin-F：5′-TTT TCC TTT TGC GGC CGC TTA GTC AGC TTC AGT CTC G -3′，其中下划线部分为Notc酶切位点； Stathmin-R：5′-CG GAA TTC CAC CAC CAC CAC CAC CAC ATG GCT TCT TCT GAT-3′，其中下划线部分为EcoRⅠ酶切位点，波浪线部分为His标签。

1.2方法

1.2.1Stathmin基因片段扩增根据GeneBank(X53305)人Stathmin基因序列，设计合成用于扩增Stathmin全长基因的Stathmin-F,Stathmin-R引物，提取乳腺癌细胞系SKBR3细胞总RNA,反转录为cDNA模板，常规PCR方法扩增Stathmin全长基因。反应体系按照说明书进行，PCR反应条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30个循环，72 ℃ 10 min。

1.2.2重组pPIC3.5K质粒建立用EcoRⅠ和NotⅠ分别双酶切全长Stahtmin基因片段及pPIC3.5K载体37 ℃，4 h。琼脂糖电泳后分别回收目标片段并纯化。将Stathmin基因克隆入pPIC3.5K载体相应位点，用氯化钙法转化入E.coli JM109感受态，挑取菌落，提取质粒，经双酶切和PCR鉴定，筛选阳性克隆命名为pPIC3.5K-Stathmin并且进行基因测序，确定没有突变。

1.2.3酵母感受态的制备 挑取酵母菌GS115于100 mL酵母膏胨葡萄糖琼脂(YPD)培养基中，28 ℃，250 r/min培养16 h，待OD值达1.0～1.5，4 000 r/min，5 min，4 ℃离心集菌。沉淀用50 mL预冷灭菌水洗涤1次，再用20 mL预冷1 mol山梨醇洗涤1次后，用1 mL山梨醇重悬后冰浴。制备成酵母菌GS115感受态。

1.2.4Stathmin酵母表达载体的构建重组质粒pPIC3.5K-Stathmin用Sal1内切酶线性化处理，电转化法转入GS115感受态后，涂布于MD平板，28 ℃培养48 h。将培养出的克隆稀释后涂布到含有G418分别为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL的YPD平板，28 ℃孵育2～3 d，筛选出高拷贝克隆。挑取单克隆至MGY液体培养基中，28 ℃培养48 h后提取酵母菌基因组DNA，用PCR鉴定Stathmin与酵母基因组是否整合成功。

1.2.5甲醇诱导表达及鉴定取PCR鉴定阳性克隆接种于5 mL BMGY培养液中，于28 ℃培养18 h，至OD600为2.0～6.0时，2 000 r/min离心5 min集菌，用适量BMMY培养液重悬，使OD600值在1.0～1.2。加入甲醇溶液诱导表达，使甲醇总浓度维持在0.5%，每24 h补充1次甲醇。培养96 h后，用Western Blotting对表达产物进行鉴定，并以pPIC3.5K空载体为阴性对照。

1.2.6Stathmin蛋白的纯化和鉴定采用Anti-His-tag亲和层析柱对Stathmin蛋白进行纯化。收集诱导表达的毕赤酵母，加液氮研磨破壁20 min，用1 mL PBS进行重悬，4 000 r/min离心5 min后，取上清14 000 r/min离心4 min，再用0.45 nm滤膜过滤后，加入Anti-His-tag亲和层析柱进行纯化，收集流穿液。用5倍床体积PBS进行洗柱后，再用50、100、150、200 mmol/L咪唑分别进行洗脱。并将洗脱液收集，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western Blotting对Stathmin蛋白进行鉴定。

2结果

2.1Stathmin基因片段扩增结果以乳腺癌SKBR3细胞cDNA为模板，PCR扩增Stathmin基因片段，经琼脂糖凝胶电泳，可见一条约450 bp的片段，与预期Stathmin基因片段大小符合，见图1。

2.2重组pPIC3.5K-Stathmin质粒的鉴定重组质粒经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，进行琼脂糖凝胶电泳，可见一条9 000 bp和一条450 bp的条带，符合预期，见图2。阳性克隆送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序鉴定结果显示序列正确，与Genebank X53305一致，见图3(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。

M:DNA标志物DL2000；1:Stathmin PCR产物。

图1琼脂糖凝胶电泳Stathmin基因片段PCR扩增结果

M:DNA标志物DL2000；1:pPIC3.5K-Stathmin。

图2pPIC3.5K-Stathmin重组表达载体的双酶切鉴定结果

2.3重组毕赤酵母菌的构建、筛选和鉴定在含有0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL不同梯度G418的YPD固体培养基上抗性筛选毕赤酵母转化子，提取基因组DNA为模板，进行PCR鉴定，出现预期450 bp的条带,见图4。

M:DNA标志物DL2000；1:pPIC3.5K空载体；2～6:分别为0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL G418 YPD 筛选的pPIC3.5K-Stathmin转化子。

图4pPIC3.5K-Stathmin重组转化的

毕赤酵母的PCR鉴定

2.4目的蛋白的纯化和鉴定采用Anti-His-tag亲和层析柱对表达的Stathmin蛋白进行纯化。经SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，凝胶上出现相对分子质量约为35×103的条带,见图5。分别用His抗体和Stathmin抗体进行Western Blotting鉴定，分别在胶片上同样相对分子质量大小出现条带，蛋白鉴定为Stathmin蛋白。相对分子质量较预期19×103偏大，与添加His标签和蛋白糖基化有关，空载体转化的毕赤酵母菌作为阴性对照，没有出现相应条带，见图6。

M:蛋白质标志物；1:培养液上清;2:上样液;3:流穿液;4:PBS洗脱液;5～8:分别为50、100、150、200 mmol/L咪唑洗脱液;9:PBS洗脱液。

图5SDS-PAGE 鉴定表达和纯化的Stathmin蛋白

1:阳性对照；2:阴性对照；3:Stathmin蛋白。

图6Western Blotting鉴定Stathmin蛋白

3讨论

Stathmin是一种由149个氨基酸残基组成的可溶性、高度保守的细胞质磷蛋白。它的相对分子质量约为19×103，分为2个区域。一个是N端的“磷酸化”区域，其含有Ser16、Ser25、Ser38和Ser63共4个丝氨酸磷酸化位点[7]。另一个是C端的“功能”区域，该区域可以和微管的α/β异源二聚体螯合形成紧密的T2S三聚体复合物，从而调节微管蛋白的功能[8]。该蛋白广泛存在于各种脊椎动物细胞中，主要通过与微管系统作用发挥功能，Stathmin蛋白作为一种基本的微管解离蛋白，通过结合微管蛋白参与微管和纺锤体的组装和活化调节。此外，Stathmin不仅能和多种其他蛋白结合，也是许多细胞内蛋白激酶的底物,Stathmin还在不同的细胞周期通过修饰Stathmin蛋白的不同磷酸化位点而改变微管蛋白的聚合从而调控细胞的增殖、分化和运动[9-11]；同时，许多癌基因及抑癌基因的表达产物，还有大量的细胞因子均可通过不同的方式与Stathmin作用而引起肿瘤细胞生物学行为的改变。另外，Stathmin可以作为信号转导子，参与信号通路活性调节，在细胞的生长发育过程中发挥了非常重要的作用。Stathmin与肿瘤的发生发展关系密切，作为潜在的肿瘤标志物和新的肿瘤生物治疗靶点，Stathmin蛋白表达系统的建立对进一步研究肿瘤靶向治疗药至关重要。

毕赤酵母表达系统与传统的大肠杆菌表达系统相比，毕赤酵母作为单细胞真核生物，不但具有原核生物生长快速、培养基廉价和实验手段简单等特点，还具备真核生物可对表达蛋白进行加工折叠和翻译后修饰等生物学特性，并且克服了原核表达系统表达产物多以包涵体形式存在，复性困难且效率低下，背景蛋白多、不易纯化的缺点。而相较酿酒酵母表达体系，毕赤酵母具有更强有力的启动子、分泌效率有所提高，表达质粒更稳定等特性。并且还具有可以通过高密度发酵获得大量产物，且分泌产物无过度糖基化，临床应用安全等特点[12]。本研究使用pPIC3.5K载体构建Stathmin毕赤酵母表达体系，使用的醇氧化酶基因(AOX)启动子为强诱导型启动子，可有效地调控外源基因的高效表达。在Stathmin蛋白上加入了6×His-tag表达标签，用优质带镍离子的亲和纯化柱进行纯化，目标蛋白纯度高，方法简单。

构建Stathmin毕赤酵母表达体系，纯化Stathmin蛋白，将有利于发现Stathmin蛋白的拮抗蛋白或多肽，为新的肿瘤生物治疗靶向药物的产生奠定基础。同时，也可以更好地研究Stathmin 蛋白与其他蛋白相互作用关系以及Stathmin在信号通路中的作用，进一步深入地了解Stathmin在肿瘤发生发展中的作用。Stathmin 作为新的肿瘤标志物和肿瘤生物治疗新靶点，将发挥更加重要的作用，成功构建Stathmin毕赤酵母表达体系为Stathmin的进一步研究奠定重要基础。

参考文献

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Construction and identification of Stathmin gene Pichia pastoris expression system*

YangMing,LinFang,HeTing,DongKe,ZhangHuizhong△

(CentralLaboratory,TangduHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710038,China)

Abstract:ObjectiveTo provide the experimental basis for the further research of the interacting proteins with Stathmin，the Stathmin gene Pichia pastoris expression system was constructed，the expressed Stathmin product was purified and identified.MethodsStathmin gene was amplified from tumor cell line of SKBR3 by PCR method and cloned into the yeast expression vector pPIC3.5K.The recombinant vector pPIC3.5K-Stathmin was constructed and transformed into Pichia pastoris GS115.The positive clones were screened by YPD medium containing Geneticin 600 μg/mL.Expression was induced with 0.5% methanol and expression products were identified by SDS-PAGE and Western Blotting.ResultsDNA sequencing result showed that the gene fragment was consistent with Stathmin gene sequence.pPIC3.5K-Stathmin was selected from YPD culture medium containing Geneticin,and the positive clones were identified by PCR.SDS-PAGE showed that a 37×103 protein band could be seen on the PAGE gel after Coomassie Blue staining,which was further confirmed and identified as Stathmin protein by Western Blotting.ConclusionStathmin yeast expression vector is successfully constructed and expressed in Pichia pastoris,which laid the foundation for the study of interacting proteins with Stathmin,and for the preparation of the biological treatment drugs of Stahtmin target.

Key words:gene;Pichia pastoris expression system；identify

(收稿日期：2015-12-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.001

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)09-1161-03

*基金项目：国家自然科学基金资助项目(81372836)。

作者简介：杨铭，女，检验技师，主要从事肿瘤生物治疗研究。△通讯作者，E-mail：zhz328@yahoo.com.cn。

杨铭,林芳,和婷,董轲,张惠中△