贺尔奇 Pan Yong-Bao 付瑜华 雷石富 李向勇 卢加举 张正学

摘要：【目的】對9个果蔗品种（系）进行遗传多样性分析并构建其DNA指纹图谱，为果蔗品种鉴定和分子育种等提供理论依据。【方法】利用21个SSR分子标记和毛细管电泳技术对来自4个省份的9个果蔗品种（系）进行遗传多样性分析，应用NTSYS-pc 2.11计算供试材料间遗传相似系数，并运用UPGMA法进行聚类分析，同时构建其DNA指纹图谱。【结果】21对SSR引物共扩增出204条带，多态性比例为75.99%，每对引物可扩增出4～31条带，平均为9.71条。其中，17对引物含有9个果蔗品种（系）的44个特征位点，仅有5对引物鉴别能力最强，单个引物即可将其完全区分开。选择多态性高、鉴别力强且含有品种（系）特征位点的3对引物（SMC36BUQ、SMC597CS和SMC851MS）构建了9份果蔗品种（系）基于44个位点的DNA指纹图谱。9份果蔗材料的遗传相似系数为0.62～0.90，平均为0.77。UPGMA聚类结果显示，9个果蔗材料可分为三大类群，且与材料来源地无直接关系。【结论】9个果蔗品种（系）间的遗传基础差异较小，亲缘关系较近，遗传多样性并不丰富，在育种中应加大果蔗亲本遗传背景的差异，提高其遗传多样性。

关键词： 果蔗；SSR；遗传多样性；DNA指纹图谱

中图分类号： S566.1 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）11-1815-07

Abstract：【Objective】In order to provide theoretical basis for variety identification and parental selection during su-

garcane breeding process，the present study was conducted to analyze genetic diversity of nine chewing cane varieties（lines） and construct their DNA fingerprints. 【Method】Combining twenty-one SSR molecular markers with capillary electrophoresis technique，genetic diversities of nine chewing cane varieties（lines） from four provinces were analyzed，and genetic simi-

larity coefficient between tested materials was calculated using NTSYS-pc 2.11. Then nine chewing cane varieties（lines） were clustered for analysis using UPGMA，and their DNA fingerprints were constructed. 【Result】Results showed that，a total of 204 bands were amplified from nine chewing cane varieties（lines） using twenty-one pairs of SSR primers，with polymorphic rate of 75.99%. So every pair of SSR primers could amplify 4-31 bands，with an average of 9.71 bands. Seventeen pairs of primer contained 44 cultivar-specific loci of nine chewing cane varieties（lines）. Only five pairs of primers had the strongest ability to discriminate nine chewing cane varieties（lines），and each pair of primer was able to discriminate each chewing cane varieties（lines）. However，only three pairs of primers（SMC36BUQ，SMC597CS and SMC851MS），which were characterized by high polymorphism and discriminability and contained cultivar-specific loci，were chosen to construct DNA fingerprints of nine chewing cane varieties（lines）. Furethermore，genetic similarity coefficients among nine chewing cane varieties（lines） varied from 0.62 to 0.90，with an average of 0.77. UPGMA clustering result showed that，nine chewing cane materials were clustered into three groups，this result was not related to origins of materials. 【Conclusion】There are little differences in genetic basis，close genetic relationship and poor genetic diversity among nine chewing cane varieties（lines），so genetic background of parents should be increased in breeding process of new varieties.

Key words： chewing cane； SSR； genetic diversity； DNA fingerprint

0 引言

【研究意义】果蔗是一种可直接食用的水果甘蔗，具有皮薄质脆、汁多清甜、易咀嚼等特点，可用于解渴、解毒和保健，深受人们的喜爱（李瑞美等，2015）。近年来，随着果蔗经济价值的提高，我国果蔗生产发展迅速，尤其在福建、广东、广西和贵州等地，其中以广西推广面积最大，仅百色隆林县就超过100 ha，年收入超过2000万元（马世荣，2015），但仍无法满足人们日益增长的需求（卢庆伟等，2015）。甘蔗常规育种工作量大、育种周期长、效率低，是当前甘蔗育种面临的巨大挑战。SSR（Simple sequence repeats）是基于PCR扩增的分子标记，具有数量多、多态性高、重复性好、不受环境因素和生育期的影响等优点，已广泛应用于物种遗传多样性分析、种质鉴定、基因定位及辅助育种等研究。因此，利用SSR分子标记分析现有果蔗品种的遗传多样性并构建其DNA指纹图谱，对果蔗育种、品种鉴定及种质评价具有重要意义。【前人研究进展】目前，已有大量利用SSR分子标记分析小麦（王立新等，2007）、大豆（赵波等，2008）、马铃薯（段艳凤等，2009）、玉米（邵香兰，2009）、棉花（尤春源等，2014；戴宝生等，2015）、水稻（蔡海亚等，2015）等作物的遗传多样性并构建其DNA指纹图谱的研究报道。有关甘蔗遗传多样性分析研究报道较多，但有关其指纹图谱构建的研究报道较少。Pan等（2003a，2003b）和Pan（2006）建立了基于毛细管电泳技术的甘蔗SSR分子标记检测体系，利用该体系对甘蔗进行遗传分析并构建育种常用亲本基因型数据表，剔除错标的无性系，大幅度提高了SSR分子标记在甘蔗育种效率。Chen等（2009）利用20个SSR分子标记对不同国家的35个甘蔗品种及5个近缘野生种进行遗传亲缘关系分析，研究发现40份材料的聚类结果与品种来源地和甘蔗演化进程中近缘野生种的利用率顺序基本一致。梁俊等（2010a，2010b）将SSR分子标记与毛细管电泳技术相结合对甘蔗属3个不同种的12个材料进行遗传多样性及遗传关系分析，并对52个甘蔗品种进行同源性分析，结果表明参试品种间同源性为55%～87%，彼此间遗传基础相近，且构建了基于141个SSR分子标记的指纹图谱数据库。刘新龙等（2010a，2010b）利用SSR分子标记對云南甘蔗品种进行遗传关系及遗传多样性分析，为当地甘蔗育种亲本选择和杂交组合配制提供理论指导，并从18个质量性状和5个数量性状对73个云南甘蔗品种和27个其他省份主栽甘蔗品种进行遗传变异和遗传多样性分析，结果表明品种的遗传相似性处于中等水平。姚春雪等（2011）对67份崖城89/9×昆明蔗茅杂种不同世代及其亲本材料进行SSR多态性分析，并利用234个SSR分子标记组合构建供试材料的DNA指纹图谱数据库，结果表明杂交后代材料间存在明显的遗传差异。【本研究切入点】虽然果蔗具有较高的经济价值，但基于分子标记的遗传多样性分析、种质鉴定、基因定位及辅助育种等研究远落后于糖蔗，鲜见果蔗遗传多样性分析并构建其DNA指纹图谱的研究报道。【拟解决的关键问题】将SSR分子标记和毛细管电泳技术相结合，以来自4个省份的9个果蔗品种（系）为试验材料，利用21对SSR引物对其进行遗传多样性分析并构建DNA指纹图谱，为果蔗的生产应用及种质创新提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试果蔗材料（表1）由贵州省亚热带作物研究所望谟甘蔗育种场提供。在甘蔗生长期，剪取各果蔗品种（系）植株顶部新鲜叶片，装入15 mL离心管中，-20 ℃保存备用。选用21对多态性较高的引物（表2）（Pan，2006；Chandra et al.，2014），并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，且上游引物5'端标记FAM。主要仪器设备：SANYO SIM-F14全自动制冰机、LDZX- 40B立式自动电热压力蒸汽灭菌锅、TGL-16G高速台式冷冻离心机、DYY-6B电泳仪、GELl-DOC2000凝胶成像分析仪、Bio-Rad PCR扩增仪、ABI 3730XL电泳仪等。CTAB提取液：100.00 mmol NaCl，20.00 mmol EDTA（pH 8.0），2% CTAB（w/v），100.00 mmol Tris- HCl；苯酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1），氯仿/异戊醇（24∶1）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 基因组DNA提取 果蔗DNA提取参照Pan等（2000）的方法，用分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度，-20 ℃保存备用。

1. 2. 2 PCR扩增与毛细管电泳 PCR反应体系10.00 μL：dNTP 80.00 mmol/L，上、下游引物各0.20 mmol/L，DNA模板10.0 ng，MgCl2 2.50 mmol/L，KCl 50.00 mmol/L，Tris-HCl 10.00 mmol/L和1.0 U Taq DNA聚合酶。扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，退火30 s（退火温度见表2），72 ℃ 30 s，进行30个循环；72 ℃延伸2 min。对PCR产物进行毛细管电泳分离，GS500为分子量内标，估算扩增片段大小。

1. 2. 3 数据分析 根据9个果蔗材料的毛细管电泳图谱，计算条带数目、大小和多态性比例，应用NTSYS-pc 2.11计算各材料间遗传相似系数；运用UPGMA法进行聚类分析；利用GeneMapper v3.0和Powerpoint制作毛细管电泳分离图谱，再根据无带和有带情况转化为0、1数据矩阵。

2 结果与分析

2. 1 SSR多态性分析结果

对9个果蔗材料的PCR产物进行毛细管电泳分离，并通过GeneMapper v3.0和Powerpoint制作其毛细管电泳分离图谱（图1）。以SMC336BS为引物的扩增条带大小在141～183 bp，条带数在不同供试果蔗品种（系）间不同，其中以黔糖3号、黔蔗06/126和黔糖08/688的最多，达5条。此外，根据21对SSR引物扩增产物的毛细管电泳分离图谱，对9个果蔗材料进行SSR多态性分析，结果如表3所示，21对SSR引物共扩增出204条带，条带大小为38～258 bp，多态性条带145条，多态性条带比例为35.48%～100.00%，平均为75.99%。每对引物可扩增出4～31条带，平均为9.71条。此外，21对SSR引物中有17对含9个果蔗品种（系）的44个特征位点，可作为品种（系）的特异引物，利用特异引物可快速与其他8个材料区分开。其中，有5对SSR引物（SMC31CUQ、SMC36BUQ、SMC597CS、SMC851MS和mSSCIR43）鉴别能力最强，仅用单对引物即可将9份果蔗品种（系）区分开。

2. 2 遗传相似性分析结果

利用NTSYS-pc 2.11对9个果蔗材料进行遗传相似性分析，结果如表4所示，9个果蔗品种（系）的遗传相似系数为0.62～0.90，平均为0.77，表明其遗传多样性并不丰富。其中，黔糖3号和黔糖08/688间的遗传相似系数最大，为0.90，表明两者的遗传基础一致性较高，亲缘关系较近；沱江红和安徽白皮间的遗传相似系数最小，为0.62，表明两者的遗传基础差异较大，亲缘关系较远。贵州选育的黔糖系列（黔糖06/222、黔糖5号、黔糖3号和黔糖08/688）果蔗无性系间的相似系数为0.68～0.90，亲缘关系较近。

2. 3 聚类分析结果

基于SSR分子标记对9个果蔗品种（系）进行聚类分析，结果如图2所示，在遗传相似系数为0.684处，可将9个果蔗品种（系）分为三大类群：类群I包括2个果蔗品种和1个品系，分别为安徽白皮、广东黄皮和黔糖06/222；类群II为最大类群，包括2个果蔗品种和3个品系，又可进一步分为两个亚类群（A和B），A类群包括黔蔗06/126、黔糖3号、黔糖08/688和四川白善蔗；B类群仅包括黔糖5号；类群III仅包括沱江红。上述结果表明，9个果蔗品种（系）的遗传基础差异较小，亲缘关系较近，聚类结果和材料的地理来源无直接关系。

2. 4 指纹图谱构建

根据用最少的引物构建供试材料DNA指纹图谱的原则，并综合考虑该指纹图谱的广泛适用性，即在扩充供试果蔗材料的情况仍具有种质鉴别能力。本研究根据各供试品种（系）特征位点选用多态性高、鉴别能力强的3对SSR引物（SMC36BUQ、SMC597CS和SMC851MS）构建了其DNA指纹图谱。由表5可知，从9个果蔗材料共扩增出44个特征位点，且品种（系）间DNA指纹图谱存在明显差异，表明利用该指纹图谱可将9个供试品种（系）进行区分。因此，所建立的指纹图谱可用于果蔗品种（系）的亲缘关系和品种鉴定。

3 讨论

本研究选用的21对SSR引物在甘蔗属不同栽培种和野生近缘种的遗传基础评价中均表现出高多态性（梁俊等，2010b；刘新龙等，2010b；姚春雪等，2011），已被广泛应用于甘蔗品种选育和种质鉴定（Pan et al.，2003a，2003b；Pan，2006；Chen et al.，2009）。虽然我国目前尚无统一的甘蔗分子身份数据库，但作为被世界甘蔗育种家广泛采用的SSR引物，这21对SSR引物可视为甘蔗遗传基础评价的核心SSR引物。因此，本研究获得的9个果蔗品种（系）的SSR多样性分析结果，具有广泛适用性，可为不同蔗区果蔗品种（系）的真实性检测提供依据。另外，17个SSR引物含有9个果蔗品种（系）的44个特征位点，因此，在甘蔗种质区分或品种鉴定研究中，若供试材料包含9个果蔗品种（系）中的其中之一时，可选用该果蔗品种（系）的特异引物快速准确将其与其他材料区分开。本研究根据用最少的引物组合鉴别尽可能多的供试材料原则，并综合考虑指纹图谱广泛适用性，选用多态性高、鉴别能力强并含有特征位点的3对SSR引物构建了基于44个特征位点的9个果蔗品种（系）的DNA指纹图谱，可为保护育种机构的知识产权提供科学依据。

此外，本研究发现9个果蔗品种（系）的遗传基础一致性较高，遗传多样性并不丰富，且聚类分析结果和材料的地理来源无直接关系。该结论与梁俊等（2010b）的研究结果一致，其原因主要为包括果蔗在内的甘蔗育种均为高贵化育种，现代甘蔗栽培品种的血缘主要来自于热带种和割手密。虽然供試果蔗品种（系）来自不同省份，但由于选用的亲本遗传基础相近，导致育出的果蔗品种（系）间遗传基础差异较小。因此，果蔗新品种的选育应像糖蔗一样，在保证适口性和商品性的同时，适当引入斑茅、蔗茅等野生近缘种的遗传资源，扩大果蔗品种（系）的遗传多样性。

4 结论

9个果蔗品种（系）间的遗传基础差异较小，亲缘关系较近，遗传多样性并不丰富，在育种中应加大果蔗亲本的遗传背景差异，提高果蔗品种（系）的遗传多样性。

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（责任编辑 陈 燕）