刘 冰张俊伶李德冠潘 金王月英姚春所侯 琦孟爱民

1（北京协和医学院 中国医学科学院医学实验动物研究所 北京100021）2（北京协和医学院 中国医学科学院放射医学研究所 天津300192）3（北京协和医学院 中国医学科学院药物研究所 北京100050）



Vam3对小鼠体外胸腺细胞的辐射防护效应

刘 冰1张俊伶2李德冠2潘 金1王月英2姚春所3侯 琦3孟爱民1

1（北京协和医学院 中国医学科学院医学实验动物研究所 北京100021）2（北京协和医学院 中国医学科学院放射医学研究所 天津300192）
3（北京协和医学院 中国医学科学院药物研究所 北京100050）

摘要探讨白藜芦醇二聚体(Amurensis H, Vam3)对辐射致小鼠胸腺细胞损伤的保护作用。体外无菌分离小鼠胸腺细胞，实验分为6组：对照组(Control)、白藜芦醇组(Resveratrol, Res)、Vam3组、照射组(Irradiation, IR)、照射+ Res组和照射+Vam3组。照射+Res组和照射+Vam3组于照射前30 min给予Vam3和Res孵育，对照组、Res组、Vam3组以及照射组加等量RPMI-1640培养基或对应药物处理，除对照组、Res组和Vam3组外，其余3组均给予4 Gy137Cs γ-射线单次照射。照射后分别用生物发光法检测小鼠胸腺细胞活力，活性氧探针(DCFH-DA)检测细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平，荧光抗体标记检测γ-H2AX表达水平以及FITC-Annexin V和PI双染标记法检测细胞早期凋亡率。结果显示，与对照组比较，照射组细胞活力显著下降，细胞内ROS和γ-H2AX水平明显升高，同时细胞早期凋亡数目增加；而照射+Vam3组与照射+Res组比较显示，Vam3在提升细胞活力，降低细胞内ROS和γ-H2AX水平以及抑制细胞凋亡方面的作用比Res更加明显。研究结果表明，Vam3对辐射引起的小鼠胸腺细胞急性损伤有一定保护作用，且保护作用优于白藜芦醇。关键词 白藜芦醇二聚体，白藜芦醇，胸腺细胞，辐射损伤，辐射防护剂

基金资助：国家自然科学基金面上项目(81372928、81573094)和国家自然科学基金青年基金项目(81402633)资助

第一作者：刘冰，男，1988年2月出生，2013年毕业于河南科技大学临床医学专业，现为中国医学科学院医学实验动物研究所放射医学专业硕士研究生，E-mail: xieheliubing@163.com

Supported by the National Natural Science Foundation of China(81372928, 81573094, and 81402633)

First author: LIU Bing (male) was born in February 1988 and graduated from Henan University of Science and Technology. Now he is a master candidate in the Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences, majoring in radiation

medicine, E-mail: xieheliubing@163.com

Received 20 October 2015; accepted 6 November 2015

CLC TL71, R551

电离辐射引起的免疫系统损伤是辐射损伤的主要表现之一，在受到照射后免疫细胞易发生凋亡、坏死，导致机体免疫功能下降，引起继发感染等并发症[1]。胸腺是机体重要的中枢免疫器官，淋巴细胞在此发育、分化和成熟，对辐射十分敏感，因此，胸腺细胞的辐射反应是辐射免疫学研究的重点[2]。白藜芦醇二聚体(Amurensis H, Vam3)是从山葡萄根中获得的天然二苯乙烯低聚体类化合物，在植物体内含量较低，现在可以用白藜芦醇(Resveratrol, Res)为原料化学合成，为Res的二聚体类同系物。前期的研究结果证实，Res对辐射引起的造血免疫系统具有较好的防护作用，能显著改善辐射引起的造血免疫系统损伤[3]。有研究发现，Vam3可以通过降低细胞内ROS水平进而抑制烟雾凝集物诱导的人支气管上皮细胞自噬，且效果优于白藜芦醇[4]。而有关Vam3对造血免疫系统的辐射损伤防护作用的报道较少。本研究根据Vam3能够降低细胞内ROS水平这一特点，以Res为阳性对照药物，观察Vam3 对C57BL/6小鼠胸腺细胞的辐射损伤保护作用，为该天然化合物开发成为一种新型辐射防护药物提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

无特殊病原体(Specific pathogen free, SPF)级C57BL/6雄性小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号[SCXK（京）2012-0001]，体质量18～22 g。饲养于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心。

1.2 试剂与仪器

Vam3和白藜芦醇（中国医学科学院药物研究所惠赠）；无支原体胎牛血清（美国Gibco公司）；RPMI-1640培养基（北京赛默飞世尔生物化学制品有限公司）；二甲基亚砜(DMSO)（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；活性氧ROS探针（江苏碧云天生物技术有限公司）；细胞活力检测试剂（美国Promega公司）；γ-H2AX抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；兔抗小鼠IgG抗体（上海拜沃生物科技有限公司）；细胞凋亡检测试剂盒（美国eBioscience公司）；多功能酶标仪（瑞士TECAN公司，型号Infinite M200）；流式细胞仪（美国BD Bioscience公司，型号C6）；137Cs γ-射线照射源（加拿大原子能有限公司，型号USD Autoce1140）。

1.3 小鼠胸腺淋巴细胞分离

将用乙醚麻醉后的C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，并置于75%乙醇浸泡消毒20 min。在超净台无菌剪开小鼠胸腔，取出胸腺，加入无菌PBS缓冲液研磨，用无菌200目筛网过滤至离心管，制备单细胞悬液。之后离心（条件1500 r/min，5 min）弃上清液，将细胞重悬于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基里。用血细胞计数仪计数，调整细胞浓度为2×106mL−1使用。

1.4 Vam3毒性检测

用二甲基亚砜(DMSO)溶解Vam3和Res粉末，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释Vam3 和Res溶液，调整药物浓度为2×10−2、2×10−3、2×10−4、2×10−5、2×10−6、2×10−7mol/L。取调整好的浓度为2×106mL−1的胸腺细胞，以每孔100 µL接种至96孔板，对照组每孔加等量RPMI-1640培养基代替，其他组每孔加入100 µL相对应的不同浓度的Vam3和Res药物孵育，培养12 h后每孔加入20 µL生物发光试剂Celltiter-GloTM，反应20 min，用多功能酶标仪检测细胞活力（生物发光值）。

1.5 实验分组与照射

将胸腺细胞悬液分为6组：对照组(Control)、Res组、Vam3组、照射组(IR)、照射+Res组和照射+Vam3组。对照组和照射组：取500 µL胸腺细胞悬液，加入等量含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，小心吹打混匀。Res组和Vam3组：取500µL胸腺细胞悬液，加入等量浓度为2×10−6mol/L的Res 或Vam3药物，小心吹打混匀。照射+Res组和照射+Vam3组：取500µL胸腺细胞悬液，加入等量药物浓度为2×10−6mol/L的Res或Vam3，并吹打混匀。将各组细胞放入37℃ 5% CO2孵箱中孵育30 min后，照射组、照射+Res组及照射+Vam3组给予一次性4 Gy137Cs γ-射线辐射，剂量率为1 Gy/min，而其余3组给予假照射。

1.6 细胞活力测定

照射完毕后接种于96孔板，每孔200µL，培养12 h后每孔加入20 µL生物发光试剂Celltiter-Glo TM，室温避光震荡20 min，多功能酶标仪检测细胞活力。

1.7 细胞内ROS水平检测

照射之后将细胞接种至24孔板，放入37℃5% CO2培养箱孵育6 h后，将各组细胞收集入2 mL EP管内。将细胞离心后弃上清，取细胞沉淀，按无血清RPMI-1640与DCFH比例为3000:1的比例稀释活性氧检测探针，之后每管内加入500 µL活性氧检测探针，于37℃水浴锅内孵育20 min，用RPMI-1640培养基洗涤细胞2次以洗去未结合的活性氧探针，然后用300µL无血清RPMI-1640培养基重悬细胞，流式细胞仪检测细胞内平均荧光强度(DCF MFI)。

1.8 细胞内γ-H2AX水平检测

照射完毕后收集细胞，接种于24孔板，在37℃5% CO2培养箱内孵育培养3 h，之后将各组细胞取出加入2 mL EP管内，离心（条件同上）后弃上清，每管加固定破膜液100µL室温孵育30min，用1×wash buffer液洗涤两遍后离心（条件同上）弃上清，然后加入抗γ-H2AX抗体，每管加0.5 µL，室温孵育1 h，离心弃上清后加入FITC荧光素标记兔抗小鼠IgG二抗，室温避光孵育30 min。PBS缓冲液洗涤细胞二次以洗掉多余抗体，加300µL PBS重悬，用流式细胞仪测定平均荧光强度。

1.9 细胞凋亡测定

照射之后将细胞接种于24孔板，放入37℃5% CO2培养箱孵育4 h后将各组细胞收集入2 mL EP管内，离心（条件同上）后弃上清，然后用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒对细胞进行标记。则早期和晚期凋亡细胞分别被Annexin V（Annexin V+单阳）及Annexin V和PI（Annexin V+/ PI+双阳）标记，坏死的细胞仅被PI 标记（PI+单阳），正常活细胞未被标记（Annexin V−/PI−双阴），然后用流式细胞仪分析胸腺细胞早期凋亡细胞百分率。

1.10 统计学方法

所有实验结果均以x± s表示，组间比较用独立样本t检验。用GraphPad Prism 5软件对实验数据进行处理分析，p<0.05为差异有统计学意义。

2 结果及分析

2.1 Vam3对小鼠胸腺细胞的毒性作用不同浓度梯度Vam3处理细胞后发现，1×10−5、1×10−6、1×10−7mol/L药物浓度未表现出毒性作用，似乎对细胞有促进增殖作用，与对照组相比，细胞活力依次提升15% (p<0.01)、23% (p<0.001)和14% (p<0.01)，在该浓度范围里1×10−6mol/L浓度对细胞保护作用最强。而之后随着药物浓度增加1×10−3和1×10−4mol/L浓度的Vam3处理细胞后，与对照组相比，细胞活力分别下降14%和68%，表现出一定的毒性作用，在1×10−2mol/L浓度时Vam3对细胞有明显毒性作用，胸腺细胞几乎全部死亡。同时，Vam3 与Res比较发现，同一浓度条件下Vam3的药物毒性要显著低于Res，见图1。

2.2 Vam3对小鼠胸腺细胞受照后活力的影响

毒性实验结果显示，1×10−6mol/L浓度的药物对胸腺细胞保护作用最明显，以下实验Res和Vam3浓度均选择1×10−6mol/L。照射前30 min对胸腺细胞进行Res和Vam3药物处理，照射后12 h收集细胞，检测细胞活力。对照组比较发现，照射组胸腺细胞活力下降为对照组的10%(p<0.001)；照射+Vam3组细胞活力提高52%(p<0.01)；且照射+Vam3组与照射+Res组比较，细胞活力显著升高(p<0.05)，说明Vam3对小鼠胸腺细胞有辐射损伤保护作用，且防护效果优于白藜芦醇，见图2。

2.3 Vam3对小鼠胸腺细胞受照后ROS水平影响

为了评价Vam3对辐射后胸腺细胞内ROS水平的影响，照射前对细胞进行药物处理，照射后6h收集细胞，流式细胞仪检测细胞内ROS水平，结果与对照组比较，照射组胸腺细胞内ROS水平升高97% (p<0.001)；与照射组相比，照射+Vam3组细胞内ROS水平下降28% (p<0.001)；且照射+Vam3组与照射+Res组比较，细胞内ROS水平下降更加明显(p<0.001)，见图3。

2.4 Vam3对小鼠胸腺细胞γ-H2AX水平的影响

于照射前对细胞进行药物处理，照射后3 h流式细胞仪检测细胞内γ-H2AX水平，结果与对照组比较，照射组胸腺细胞内γ-H2AX水平显著升高(p<0.001)；与照射组相比，照射+Vam3组细胞内γ-H2AX水平下降70% (p<0.001)；且照射+Vam3组与照射+Res组比较，细胞内γ-H2AX水平显著下降(p<0.001)，见图4。

2.5 Vam3对小鼠胸腺细胞受照后凋亡水平影响

为了评价Vam3对辐射后胸腺细胞凋亡的影响，实验于照射前对细胞进行药物处理，照射后4 h流式细胞仪检测早期凋亡细胞比例。结果与对照组比较，照射组胸腺细胞早期凋亡细胞比例显著升高(p<0.001)；与照射组相比，照射+Vam3组细胞早期凋亡细胞比例下降53% (p<0.001)；且照射+Vam3组与照射+Res组比较，早期凋亡细胞比例显著下降(p<0.05)，见图5。

3 讨论

胸腺是辐射敏感组织，受到全身及体外照射可很快引起其凋亡[2]，辐射致胸腺细胞损伤可进一步引起造血免疫系统功能障碍[5]。当电离辐射穿透生物组织时，能通过直接和间接作用产生一系列生物学效应，进而引起细胞内ROS升高、DNA单双链断裂等生物学变化导致细胞受损[6-7]。实验以白藜芦醇为阳性对照药物，探索其二聚体同系物Vam3对胸腺细胞辐射损伤保护作用。研究指标选取细胞活力、细胞内ROS水平、γ-H2AX水平以及细胞早期凋亡比例。前期的Vam3毒性实验结果显示，在同等浓度条件下Vam3对胸腺细胞的毒性作用较Res小，其毒性范围表现为1×10−7～1×10−5mol/L时对胸腺细胞活力影响不大，之后随药物浓度的增加，其毒性逐渐增强，在浓度为1×10−2mol/L时具有明显的毒性作用。而细胞活力检测是反应活细胞存活的重要指标，发光试剂中的荧光素酶只能与活细胞内ATP发生反应而被检测到，因此，检测到的生物发光值反应活细胞数目，其值越大表明细胞活力越强。实验结果显示小鼠胸腺细胞受4 Gy γ-射线辐射后，细胞活力明显下降，ROS水平升高。细胞内异常增高的ROS水平可使细胞发生氧化应激反应，从而诱导细胞凋亡甚至导致其坏死，故而有效的抗氧化剂能够减轻电离辐射引起的细胞损伤[3,8]。

H2AX是组蛋白H2A的一种亚型，活化后的γ-H2AX在辐射致DNA双链断裂修复中起重要的作用[9]。Thiriet等[10]研究发现在染色质DNA双链断裂周围出现的H2AX磷酸化核灶(Nuclear foci)几乎与DNA双链断裂呈现1:1数量关系，提示辐射后细胞内γ-H2AX水平可以清楚地反映DNA损伤程度和修复情况。实验发现辐射后胸腺细胞γ-H2AX水平显著升高，同时辐射后胸腺淋巴细胞凋亡细胞数目亦增加，提示照射可引起胸腺细胞DNA损伤，可能诱导大量胸腺细胞凋亡。

将小鼠胸腺细胞照射前30 min给予Vam3和Res药物处理，结果胸腺淋巴细胞活力下降明显减轻，胞内ROS和γ-H2AX水平以及凋亡的胸腺淋巴细胞比例明显降低，且照射+Vam3组与照射+Res组比较，Vam3在提升细胞活力、降低细胞内ROS 和γ-H2AX水平以及抑制细胞凋亡方面的作用比Res更加明显，表明Vam3对辐射引起胸腺淋巴细胞的急性损伤有保护作用，且Vam3的辐射保护作用优于其单体白藜芦醇。从结构式上分析Vam3作用优于白藜芦醇的原因可能为：白藜芦醇发挥其抗氧化能力的主要结构为其3个具有很强供电子能力的酚羟基，Vam3作为白藜芦醇的二聚体同系物，具有更多的酚羟基，因此，具有更强的抗氧化能力。同时经过结构改造的Vam3具有比白藜芦醇更低的毒性作用。Res的辐射防护作用已经得到多方面的研究证实，鉴于Vam3本身毒性很低，在一定程度上提示其可能作为一种新型辐射防护剂，本项研究对Vam3细胞保护作用进行了初探，后续尚需要更系统深入的研究证实。

参考文献

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Radiation protection effects of Vam3 on mouse thymocyte in vitro

LIU Bing1ZHANG Junling2LI Deguan2PAN Jin1WANG Yueying2YAO Chunsuo3HOU Qi3MENG Aimin11(Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)2(Institute of Radiation Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Tianjin 300192, China)3(Institute of Material Medical, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Beijing100050, China)

ABSTRACTThe aim is to observe the protective effect of Vam3 on irradiation-induced injury of thymocytes isolated sterilely from mice. The thymocytes were divided into 6 groups: control group, resveratrol group, Vam3book=71,ebook=40group, irradiation group, irradiation with resveratrol group and irradiation with Vam3 group. Except the control group, resveratrol group and Vam3 group, the rest groups were exposed to radiation at a single dose of 4 Gy γ-rays from137Cs after 30 min treatment by vehicle and tested drug, respectively. The thymocytes’ viability was measured by bioluminescence; the level of thymocytes’ reactive oxygen species (ROS) was measured by DCFH-DA; the level of thymocytes’ γ-H2AX was measured by fluorescent antibody labeling; the early apoptosis was detected by FITC-Annexin V and PI labelling using flow cytometry (FCM) after radiation. Compared with control group, the thymocytes’ cell viability decreased obviously after irradiation, and the level of cell ROS, γ-H2AX and early apoptosis cell increased. By comparing the resveratrol group and Vam3 group with the irradiation group, we can find that Res and Vam3 could reduce the decrease of thymocytes’ cell viability and inhibit the increase of ROS, γ-H2AX and early apoptosis cell induced by irradiation. The comparison between irradiation with resveratrol group and irradiation with Vam3 group showed that the effects of Vam3 in increasing cell viability, decreasing the level of ROS and γ-H2AX and lowering the early apoptosis rate were more obvious than resveratrol. It can be concluded that Vam3 performs better than resveratrol in the protection of mice thymocytes against the acute radiation injury.

KEYWORDSVam3, Resveratrol, Thymocyte, Radiation injuries, Radioprotector

Corresponding author:YAO Chunsuo, professor, E-mail: yaocs@imm.ac.cn; HOU Qi, professor, E-mail: houq@imm.ac.cn; MENG Aimin, doctoral tutor, professor, E-mail: aiminmeng@cnilas.org

收稿日期：初稿2015-10-20；修回2015-11-06

通讯作者：姚春所，研究员，E-mail: yaocs@imm.ac.cn；侯琦，研究员，E-mail: houq@imm.ac.cn；孟爱民，博士生导师，教授，E-mail: aiminmeng@cnilas.org

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.020207

中图分类号TL71，R551