孙 阳 涂 彧

（苏州大学医学部放射医学与防护学院 苏州 215123）



硫酸镁对人脐静脉血管内皮细胞的辐射防护作用

孙 阳 涂 彧

（苏州大学医学部放射医学与防护学院 苏州 215123）

摘要对数生长期的人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs) 分3组进行不同处理后采用流式细胞仪检测细胞周期分布；Annexin V/PI双染法测定细胞凋亡率；Western blot检测Bcl-2蛋白的表达情况；RT-PCR法检测Bcl-2 mRNA的表达情况。结果显示，硫酸镁可以在X-射线照射24 h后改善HUVECs细胞G2/M期阻滞；在辐照后24、48、72 h可以提高细胞对X-射线的辐射敏感性，并增加细胞凋亡率(t=4.24、7.19、3.20，p<0.05)；在辐照后48、72 h能明显抑制抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达；照后24、48、72 h 的Bcl-2 mRNA表达量减少(t=3.034、6.182、3.957，p<0.05)。结果提示，硫酸镁可以缓解X-射线照射后细胞G2/M期阻滞，增加照射后HUVECs的细胞凋亡率，降低X-射线诱导的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。

关键词硫酸镁，人脐静脉血管内皮细胞，X-射线，细胞凋亡，Bcl-2

基金资助：国家自然科学基金(K112830513)资助

第一作者：孙阳，男，1989年7月出生，2012年毕业于苏州大学放射医学与防护学院，现为该校硕士研究生，研究方向为放射损伤与防护

Supported by National Natural Science Foundation of China (K112830513)

First author: SUN Yang (male) was born in July 1989 and graduated from School of Radiation Medicine and Protection of Soochow University in 2012. Now he is a master candidate at Soochow University, majoring in radiation injury and protection

Received 19 January 2016; accepted 11 March 2016

CLC TL71

放射性脑损伤(Radiation-induced brain injury, RBI)是临床上头颈部肿瘤放射治疗过程中的比较常见并发症之一，其发病机制并无统一定论，目前认为至少有3种因素参与了中枢神经系统放射性脑损伤的发病机制：细胞损伤、血管损伤和自身免疫反应[1]。关于血管由射线引起的损伤的大部分研究都集中在内皮细胞，因为通常认为内皮细胞是血管壁最脆弱敏感的部位。电离辐射可引起不同类型的DNA损伤，影响细胞存活和死亡的主要原因是DNA的损伤修复。DNA损伤后，细胞出现G1/S和/或G2/M期的周期阻滞，细胞周期进程的抑制有利于细胞有充足的时间进行损伤修复[2]。当DNA修复不可逆转，细胞则会发生凋亡。电离辐射引起的组织损伤反应的关键步骤包括血管内皮细胞功能和结构的改变。采取有效的防护和救治措施来保护内皮细胞对预防和治疗正常组织的辐射损伤有着很大的意义。前期的实验证实，硫酸镁可以缓解电离辐射对人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)增殖的损伤，缓解细胞G2/M期阻滞，增加细胞凋亡率，修复电离辐射诱发的细胞损伤[3-4]。镁离子的应用对血管内皮细胞和血管周围组织的损伤症状的缓解有一定作用[5]。前期实验中观察到，硫酸镁通过下调核因子NF-kB的表达，减轻X-射线引起的g-H2AX蛋白的表达，从而减轻X-射线引起的DNA的双链断裂，以利于DNA损伤的修复[6]。本研究探讨硫酸镁对辐照后人脐静脉内皮细胞周期进程的改变以及细胞凋亡的情况，分析硫酸镁是否影响了细胞DNA损伤的修复。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

杜尔伯科改良伊格尔细胞培养液（DMEM，美国Hyclone公司）、胎牛血清（美国GIBCO公司）、磷酸盐缓冲液(PBS，美国Hyclone公司）、Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit（BD Biosciences，美国BD公司）、PI（Propidium iodide，美国BD公司）、硫酸镁注射液（国药集团容生制药有限公司，产品批号：12073142）、一抗兔抗人Bcl-2（美国Immuno Way公司）、二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔、逆转录试剂盒（日本Takara公司）、实时定量PCR试剂盒（上海灏勤生物公司）。

流式细胞仪（型号FC500，美国Beckman Coulter）、梯度PCR仪（德国Biometra 公司）、7500荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

1.2 细胞培养

人脐静脉血管内皮细胞为本实验室保存。选取含10%胎牛血清的DMEM培养基、在37℃、5% CO2条件下的培养箱中培养。选取对数生长期的人脐静脉血管内皮细胞进行实验。

1.3 照射条件

选用苏州大学放射医学院的X-射线机(RS-2000 Pro Biological Irradiator)进行辐照实验，设定吸收剂量4 Gy，剂量率1.2 Gy/min，照射时间196 s。

1.4 实验分组

对数生长期的人脐静脉血管内皮细胞分为空白对照组(Con)、单纯照射组(IR)和照射加药组(IR+ MgSO4) 3组。空白对照组的细胞选用含10%的胎牛血清的DMEM培养基进行处理；单纯照射组采用X-射线机辐照至吸收剂量为4 Gy；照射加药组的细胞预先采用浓度为1.25 mg/mL的硫酸镁培养液培养0.5～1 h后再用X-射线照射至吸收剂量为4 Gy。

1.5 流式细胞仪检测HUVECs的细胞周期

取对数生长期的人脐静脉血管内皮细胞进行传代、培养。X-射线照射前0.5～1 h加入1.25 mg/mL的硫酸镁，分别于照射后24、48 h两个时间段收集细胞，1000 r/min离心5 min，PBS洗涤、1000 r/min离心5 min 2次，取1×105～1×106个细胞，用预冷的浓度为70%的酒精混匀，放入−20℃冰箱过夜固定。检测前以1000 r/min离心5min，除去酒精，再用PBS洗涤细胞离心2次，加入500 mL PI混匀，室温静置0.5 h，用流式细胞仪检测。

1.6 流式细胞仪检测HUVECs的细胞凋亡率

吹打对数生长期的人脐静脉血管内皮细胞制成细胞悬液，以1×106mL−1的密度接种于6孔板中，置于培养箱中培养24 h。X-射线照射前0.5～1 h加入1.25 mg/mL硫酸镁，然后分别于照射后24、48、72 h收集细胞，1000 r/min离心5 min，去上清后PBS洗涤细胞、1000 r/min离心5 min 2次，收集l×105～1×106个细胞，加入500 mL Annexin V-FITC Binding Buffer，摇匀制成悬浮细胞，加入5mLAnnexin V FITC混匀，避光孵育15 min，再加入5 mL PI，室温下轻轻混匀于避光条件下孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率情况，激发光波长488 nm；用计算机分析细胞凋亡比率，记录细胞凋亡率。

1.7 Western blot 检测

X-射线照射后收取细胞样品置于冰上，加入细胞裂解液，离心提取细胞总蛋白，取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳并转膜，5% BSA封闭2～3 h后加入一抗(1:1000)，4℃冰箱摇床过夜16 h，二抗为辣根过氧化物酶标记山羊抗兔(1:2000)，用超敏ECL化学发光试剂盒，检测蛋白表达。

1.8 mRNA的检测

X-射线照射后收集细胞，置于冰上，抽提RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA，采用罗氏Taq man探针法检测mRNA的表达量，分析结果并计算。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 硫酸镁对X-射线照射后HUVECs细胞周期

阻滞的影响

如表1所示，与空白对照组相比，HUVECs在X-射线照射24 h后呈G2/M期阻滞；照射48 h后，G2/M期阻滞不明显，没有统计学意义。硫酸镁作用24 h后细胞G2/M期阻滞现象得到改善(p<0.05)，24 h时使照射诱导的G2/M期比例由(48.88±0.48)%降至(38±1.24)%；作用48 h后细胞G2/M期阻滞现象改善不明显，比例由(22.04±5.24)%降至(20.64±2.90)%，没有统计学意义。

表1　硫酸镁对X-射线照射后HUVECs细胞周期的影响xTable 1　Effects of magnesium sulfate on the cell cycle status of HUVECs irradiated with X-rays　　(±s, n=3, %)

表1　硫酸镁对X-射线照射后HUVECs细胞周期的影响xTable 1　Effects of magnesium sulfate on the cell cycle status of HUVECs irradiated with X-rays　　(±s, n=3, %)

注：与同一时间空白对照组比较，ap<0.05；与同一时间单纯照射组比较，bp<0.05。Note: compared with Con,ap<0.05; compared with IR,bp<0.05.

组别Groups 　24 h 　 　 　48 h G0/G1 　S 　G2/M 　G0/G1 　S 　G2/M Con 　31.82±0.14 　50.13±2.40 　18.05±2.53 　48.78±1.56 　33.45±2.24 　17.77±1.62 IR 　18.88±0.93 　32.24±0.70 　48.88±0.48a　46.4 ±0.63 　31.56±5.52 　22.04±5.24 IR+MgSO4　19.98±0.10 　42.02±1.79 　38.00±1.24b　46.36±0.84 　33.00±3.79 　20.64±2.90

2.2 硫酸镁对X-射线照射后HUVECs细胞凋亡的影响

X-射线照射后用Annexin V/PI双染法检测硫酸镁对HUVECs细胞凋亡的影响，结果如图1所示。照射后24、48、72 h单纯照射组细胞凋亡率较空白对照组均有不同程度的增加；经过1.25 mg/mL硫酸镁处理后细胞凋亡率较照射组均有不同程度的增加，作用48 h后硫酸镁处理组HUVECs细胞凋亡率改变显著。

2.3 Western blot 检测抗凋亡蛋白Bcl-2的表达

为了解释细胞凋亡率变化的结果，继续采用Western blot检测方法对照后HUVECs的Bcl-2蛋白表达量进行检测，结果显示，硫酸镁处理组Bcl-2蛋白表达量较单纯照射组明显降低，见图2。Bcl-2蛋白与b-actin蛋白的比值见图3。

2.4 硫酸镁对照后HUVECs中Bcl-2 mRNA表达

的影响

硫酸镁对照后HUVECs中Bcl-2 mRNA表达的影响见图4。

图4 硫酸镁对照后HUVECs中Bcl-2 mRNA表达的影响与单纯照射组相比，* p<0.05

Fig.4 Effects of magnesium sulfate on Bcl-2 mRNA expression of HUVECs irradiated with X-rays Compared with IR, * p<0.05

由图4可知，辐照后24 h Bcl-2 mRNA表达上升，并在照后48 h达到最高峰，与空白对照组相比，Bcl-2 mRNA表达量均升高；照射加药组的mRNA表达在不同程度上有一定的降低，与单纯照射组相比，照后24、48、72 h的降低均有统计学意义(t=3.034、6.182、3.957， p<0.05)。

3 讨论

镁是人体内必不可少的微量元素，参与合成多种必要酶和完成机体代谢等。本课题组前期的实验证实，在射线引起的大鼠脑损伤过程中，早期应用硫酸镁可以缓解射线引起的放射性脑损伤，如抑制脂质过氧化，降低体内自由基的产生，维持细胞正常代谢[7-8]。1.25 mg/mL硫酸镁能够提高X-射线照后细胞的存活率，抑制射线引起的Foci数量的增加，减少g-H2AX蛋白的表达[6]。

辐射诱导的组织反应的关键步骤为血管内皮细胞的周期阻滞和凋亡。辐射能诱导细胞出现DNA损伤，从而引起细胞出现周期阻滞。血管内皮细胞受X-射线照射后可以诱导细胞具有较强辐射敏感性的M期和G2期做出适应性改变，即引起细胞出现G2/M期阻滞[9-10]。本研究证明，浓度1.25 mg/mL硫酸镁可以有效缓解细胞G2/M期阻滞，可能改善X-射线诱发的细胞损伤。细胞对DNA损伤做出的应答有2种方式[11-12]：细胞周期阻滞为DNA损伤修复系统提供充足时间进行修复或完成DNA复制；DNA修复失败时引起细胞程序性死亡（细胞凋亡）。

细胞凋亡是由基因调控的细胞程序化死亡，其参与许多疾病的病理发病机制[13-14]。Bcl-2是一个多基因家族，其家族成员至今已发现15个以上，成员之间相互结合可形成同源或异源二聚体，通过调控相关酶的活性而双向调控细胞凋亡，其中，起促进凋亡作用的家族成员有Bak、Bax、Bad、Bcl-Xs等；抗凋亡家族成员包括Bcl-2、Bcg-l、Bcl-XL等[15-17]。Bcl-2、Bax是该家族中最具代表性的两个成员，当Bax以同源二聚体的形式存在时可促进细胞凋亡；而当Bcl-2过度表达时，Bax同源二聚体被分开，而形成Bax-Bcl-2异源二聚体，从而使细胞凋亡减少[16-18]。核转录因子NF-kB是免疫、炎症和应激反应的主要调节因子[19]。NF-kB是一类功能性蛋白质，由两个亚单位(P50、P65)构成异源二聚体。NF-kB与其抑制蛋白IkB结合后以非活性的状态存在于胞浆中，许多刺激（如电离辐射、细胞因子、病毒、紫外线和蛋白激酶C等）可使IkB磷酸化，然后泛素化降解、释放、激活NF-kB，由胞浆转入核内，与其相关靶基因中的kB基因序列结合而起到调控基因表达的作用，发挥相关生物学作用[20]。有实验证明，活化NF-kB通路，从而进一步促进抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-XL的转录，最终可以使细胞抵抗凋亡[21]。Bcl-2基因是NF-kB抗凋亡信号的关键执行者之一，Bcl-2基因启动子上存在特异性的kB结合位点，NF-kB可通过转录途径直接上调Bcl-2表达[22-24]。前期实验证明，1.25 mg/mL硫酸镁可以通过抑制NF-kB mRNA的表达，进而阻止NF-kB的核转位来降低ICAM-1 mRNA和蛋白水平的表达，从而减轻炎症反应[6]。

选用Western blot和RT-PCR两种方法研究抗凋亡蛋白Bcl-2基因的表达，从而研究硫酸镁对细胞DNA损伤修复的影响。两种检测结果都提示，电离辐射可能激活拥有kB位点的Bcl-2 mRNA和蛋白的表达，硫酸镁可能通过抑制Bcl-2 mRNA和蛋白水平的表达，从而表现为细胞凋亡的增加。

综上所述，硫酸镁可以缓解细胞G2/M期阻滞，减轻射线引起的Bcl-2的表达，从而促进细胞凋亡。而硫酸镁如何通过促进细胞凋亡发挥对HUVECs防护作用的确切机制尚有待进一步研究。

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Irradiation protection effects of magnesium sulfate on human umbilical vein endothelial cells

SUN Yang TU Yu
(School of Radiation Medicine and Protection, Medical School of Soochow University, Suzhou 215123, China)

ABSTRACTThe human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) of logarithmic growth phase were divided into three groups for different treatment. And then they were detected with the cell cycle distribution by flow cytometry, rate of apoptosis by annexin V/PI double staining method, expression of Bcl-2 protein by Western blot and expression of Bcl-2 mRNA by RT-PCR. The results showed that magnesium sulfate could advance the G2/M phase block of HUVECs after X-ray irradiation for 24 h, and improve the sensitivity of HUVECs to X-rays after irradiation for 24 h, 48 h and 72 h, increasing apoptosis rate to a certain extent (t=4.24, 7.19, 3.20, p<0.05) and decreasing Bcl-2 mRNA expression (t=3.034, 6.182, 3.957, p<0.05) after irradiation for 24 h, 48 h and 72 h, as well as inhibit the anti-apoptotic protein Bcl-2 protein expression significantly after irradiation for 48 h and 72 h. Therefore, magnesium sulfate could improve the G2/M phase arrest, increase the apoptosis rate and reduce Bcl-2 expression of HUVECs irradiated with X-rays.

KEYWORDSMagnesium sulfate, Human umbilical vein endothelial cells, X-rays, Cell apoptosis, Bcl-2

Corresponding author:Ph. D. TU Yu, professor, E-mail: tuyu@suda.edu.com

收稿日期：收稿2016-01-19；修回2016-03-11

通讯作者：涂彧，博士，教授，E-mail: tuyu@suda.edu.com

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.020201

中图分类号TL71