肖 潇马 云肖方竹唐 艳杨 奇黄 波唐 旻何淑雅,

1（南华大学公共卫生学院放射医学教研室 衡阳 421001）2（南华大学生物化学与分子生物学教研室 衡阳 421001）



耐辐射奇球菌pprI和pprA基因在真核细胞293T中的表达

肖 潇1马 云2肖方竹1唐 艳1杨 奇2黄 波1唐 旻2何淑雅1,2

1（南华大学公共卫生学院放射医学教研室 衡阳 421001）
2（南华大学生物化学与分子生物学教研室 衡阳 421001）

摘要以pGADT-7-pprA、pet28a-pprI载体为模板，构建pEGFP-N1-pprA、 pDsRed1-N1-flag-pprI真核表达载体，脂质体2000介导将两个重组载体共转入293T细胞。双酶切及琼脂糖凝胶电泳显示在4 700、1 000 bp处与4 800、1 100 bp处出现目的条带。测序结果显示构建序列与模板序列一致，氨基酸序列100%正确。荧光显微镜下见到红色和绿色荧光；Western blot结果显示在不同检测水平65 kDa及60 kDa大小处有融合蛋白表达。结果提示pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag- pprI真核表达载体构建成功，并在离体293T细胞中共同表达蛋白。证明原核基因pprI、pprA能够在真核细胞中共表达，为后续实验验证DR菌高抗性基因pprA、pprI及其产物在辐射调控网络中的相互作用和协同作用、提高真核细胞的辐射抗性提供了研究基础。

关键词耐辐射奇球菌，pprI，pprA，真核细胞，脂质体2000

基金资助：国家自然基金项目(81272993)、湖南省教育厅资助科研项目(13C805)、湖南省科技厅重点项目（2015JC3080）、湖南省研究生科研创新项目(CX2013B398)、衡阳市科技局资助项目(2014KJ10)资助

第一作者：肖潇，女，1989年4月出生，2012年毕业于湖南师范大学医学院临床医学专业，现为南华大学公共卫生学院特种医学（放射）专业研究生，E-mail：794171254@qq.com；共同第一作者：马云，女，1975年4月出生，2004年于南华大学获硕士学位，副教授

Supported by the National Natural Science Foundation of China (81272993), Education Department Scientific Research of Hunan Province (13C805), Key Program of Hunan Provincial Department of Science and Technology (2015JC3080), Graduate Student

Research Innovation Project of Hunan Province (CX2013B398), and Project of Hengyang Municipal Science and Technology Bureau(2014KJ10)

First author: XIAO Xiao (female) was born in April 1989 and graduated from Clinic Medicine of Hunan Normal University Medical Department. Now she is a master candidate at University of South China. Equally contributing author: MA Yun (female) was born in April 1975 and received her master degree from University of South China in 2004, associate professor

CLC Q691, TL71

随着核能和放射技术的发展和应用，各种突发辐射状况和放射治疗过程中都可能导致不同程度的辐射损伤，而真核生物对辐射的抵抗作用十分有限。耐辐射奇球菌(Deinococcus radiodurans, DR)是迄今为止人类发现的对辐射抗性最强的生物之一，这种原核生物能够在指数生长期耐受高达12～20 kGy的急性电离辐射损伤，并且在剂量率高达60 kGy/h的慢性照射下仍不会诱发突变[1]。pprA是DR菌在辐射压力下响应的一种DNA修复基因[2]，pprA基因产物是DR菌抵抗辐射所必须的[3]。pprI是DR修复 DNA 损伤、发挥辐射抗性的关键基因，是辐射抗性机制的总开关[4]，它在受到电离辐射的刺激后上调表达，并可以通过调节 recA、pprA等的表达显著提高DR 菌中CAT 的活性，从而提升对氧化剂的耐受，提高菌株的存活率[5]。本研究构建真核荧光表达载体，将DR菌高效抗辐射基因共转染肾上皮细胞293T，证实其能够在离体真核细胞中共同表达，为后续实验验证这两个基因提高真核细胞对辐射的抵抗能力提供研究基础。

1 材料与方法

耐辐射球菌Deinococcus radiodurans R1来自本实验室保种；pGADT-7-pprA、 pet28a-pprI重组表达载体实验室前期构建；荧光表达载体pEGFP-N1、pDsRed1-N1实验室保存；DNA marker、2x Taq Master Mix、无内毒素质粒提取试剂盒（康为世纪）；T4 DNA连接酶、BamH I、EcoR I限制性内切酶（Fermentas公司）；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（OMEGA公司）；脂质体转染试剂（Invitrogen公司）；引物合成及测序（南京金斯瑞科技有限公司）；细胞基础培养基DMEM（GIBCO公司）；胎牛血清（杭州四季清生物技术有限公司）；293T细胞本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 真核载体构建

利用Primier 5.0软件设计特异性引物，pprI基因两端分别加入EcoR I、BamH I酶切位点，5’端加入一个Flag标签。pprA基因两端分别加入EcoR I、BamH I酶切位点。pprI-F：

利用实验室前期构建的pGADT-7-pprA、pet28a-pprI为模板，进行PCR基因扩增。PCR反应条件为：预变性94℃，5min，变性94℃，45s，退火53℃(pprI) /59℃(pprA)，30s，72℃延伸1min，最后72℃延伸10min，30个循环。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收获得pprI、pprA基因片段。利用EcoR I、BamH I分别双酶切回收的pprI、pprA及pEGFP-N1、pDsRed1-N1空质粒，37℃酶切2 h后利用T4 DNA连接酶16℃连接过夜。CaCl2法将连接体系转化大肠杆菌JM109感受态细胞后涂布于Kan抗性的LB固体平板上进行筛选，置于37℃生化恒温培养箱中倒置培养过夜。随机挑选转化子进行菌落PCR验证，筛选阳性菌落。提质粒，用EcoR I、BamH I进行双酶切鉴定，挑选阳性克隆菌液进行测序分析。

1.2.2 293T细胞培养

293T细胞在含10% FBS及1%双抗的DMEM培养基中，于37℃、5% CO2饱和湿度条件下恒温培养箱中培养，取对数生长期的细胞用于实验。

职前教师根据自己设计的关于“空气质量问题”的教学方案，以少数同学为授课对象，在10~15分钟的时间内，尝试小型课堂教学，并将其教学过程录制下来．

1.2.3 基因转染293T细胞

质粒pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI 经Invitrogen公司的LipofectamineTM2000介导转染293T细胞：按照Lip2000说明书中的操作步骤，1:1比例配制重组质粒和脂质体2000的混合转染液，将转染液一滴一滴地加入各瓶细胞培养基中，37 ℃CO2培养箱中培养4 h后，将无抗无血清培养基换成正常培养基继续培养。48 h左右荧光显微镜观察红色和绿色荧光，拍照。

1.2.4 Western blot验证融合蛋白表达

收集转染后细胞提取蛋白，经过细胞裂解，BCA法测定蛋白浓度，分离胶浓度Flag检测指标为10%，GFP指标浓度为12%。SDS-PAGE胶电泳2 h后转膜1 h，封闭1 h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，显色，摄片，将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统进行灰度分析。

2 结果

2.1 真核表达载体构建

2.1.1 目的基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定

PCR扩增pprI、pprA基因，1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，在1 000、1 100 bp处可见特异性条带，与预期基因片段实际大小987、1 100 bp一致（图1和图2）。

2.1.1 双酶切产物电泳鉴定

EcoR I、BamH I酶切产物琼脂糖凝胶电泳鉴定见图3，在4700、1000bp左右有目的条带。图4中在约4800、1100 bp处有目的条带，与预期一致。

2.1.2 测序鉴定分析

阳性的质粒进一步测序验证，所得的序列在NCBI中进行序列比对，显示构建序列与模板基因碱基序列完全一致，氨基酸序列100%正确，pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-ppr1构建成功。测序结果见图5和图6。

2.2 pprI和pprA基因转染293T细胞

2.2.1 荧光显微镜荧光拍照

pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI重组荧光表达载体转染293T后24 h可观察到红色和绿色荧光，48 h左右达到最大，见图7。

2.2.2 Western blot验证融合蛋白表达

如图8和图9所示，1～5泳道分别为空白对照组、pDsRed1-N1空载体转染组、pprI基因转染组、pEGFP-N1空载体转染组、pprI、pprA双基因共转组。第5泳道可在GFP及Flag检测水平见到60 kDa 和65 kDa大小条带，为重组载体转染293T细胞所表达融合蛋白。

3 讨论

随着核能的广泛利用以及放射技术的不断发展，人类越来越关注辐射安全和防护，核辐射对环境和健康的影响日渐成为科学工作者的研究热点和难点。为了满足各类放射诊断和治疗的需要，提高辐射突发事件的应急处理，寻找提高辐射抗性的方法预防或者治疗辐射损伤非常有必要。在低剂量（几戈瑞）辐照下，人和大部分脊椎动物都将面临灭顶之灾，而耐辐射奇球菌却能够在超过15 kGy的γ-射线辐照下生长[6]，相当于大肠杆菌的250倍，人类耐受剂量的3000多倍[7]，有报道称其最高可耐受50 kGy的剂量。耐辐射奇球菌究竟是怎样在缺少一条完整模板的情况下，精确地从由辐射导致的数以百计的碎片中重组其基因组，这个谜底仍未确知；一般认为，耐辐射奇球菌并不具有特别的免受辐射损伤的能力，但是它能够在12～24 h修复每条染色体的100～200个DSBs[8-9]，并精确重组其基因组。这种高效精确的DNA修复能力主要得益于DR菌超强的辐射抗性基因。pprI基因是Earl等[10]发现并鉴定的一个具有保护作用的开关基因，是DR菌所特有的，陆续有研究将pprI转染入大肠杆菌等原核生物，烟草、油菜等植物以及酵母菌、人肺上皮细胞等真核生物中，以提高生物的辐射抵抗能力。杨占山[11]课题组还利用电转染的方法将pprI基因转入活体小鼠，救治其γ-射线损伤。作为一个辐射调控网络中的关键基因，pprI还被应用于放射性废液的处理、提高油菜的产量等。pprA是1998年由杜泽吉[12]发现并克隆的，对促进DR菌DSBs的修复，保持基因组完整性具有重要作用。其突变株在受到DNA损伤攻击后生长迟缓明显，且无核突变高[3]，而其回补株能够恢复对γ射线辐照的抗性，pprA的基因产物是DR辐射抵抗所必须的[13]。最近研究证明，pprA基因对紫外辐射和丝裂霉素C也有抵抗作用[14]。pprI通过调控recA、pprA等基因的表达来增强辐射保护作用[10]，但pprA、pprI基因及其产物是否具有协同抗辐射的作用，在真核生物中能否共同表达蛋白产物，基因共转染比单转能否呈现更好的辐射抵抗效果目前仍然未知，故本研究构建pEGFP-N1-pprA、pDsRed1-N1-flag-pprI载体，将DR菌重要的抗辐射基因pprA、pprI共同转染293T细胞。选择绿色荧光和红色荧光蛋白载体以便更好的观察转染效果。由于DR菌这两个基因尚无抗体购买，选择载体所带的GFP和插入的flag标签检测蛋白的表达。脂质体介导的基因转染方法是目前条件下最方便且转染效率较高的方法之一，转染时细胞贴壁率70%左右最佳，选用去除内毒素的质粒提取试剂盒提高转染DNA纯度对实验成功具有重要作用，脂质体和DNA的量保持1:1的比例在本实验中最佳，转染时使用无血清无抗生素的培养基也至关重要。本研究成功构建绿色和红色荧光表达载体，将原核生物的pprA、pprI基因转染离体真核细胞并成功共表达蛋白，为后续实验提高真核细胞的辐射抵抗、损伤修复能力，验证DR菌高抗性基因

pprA、pprI及其产物在辐射调控网络中的共同作用提供了实验基础。

参考文献

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Received 25 January 2016; acceppted 22 Feburary 2016
Expression of pprI and pprA genes from deinococcus radiodurans in eukaryotic 293T cells

XIAO Xiao1MA Yun2XIAO Fangzhu1TANG Yan1YANG Qi1TANG Min2HE Shuya1,21(Department of Radiation Medicine, School of Public Health, University of South China, Hengyang 421001, China)

2(Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of South China, Hengyang 421001, China)

ABSTRACTTo construct fluorescence expression plasmids pEGFP-N1-pprA and pDsRed1-N1-flag-pprI, pGADT-7-pprA and pet28a-pprI plasmid constructed at an earlier laboratory stage was used as the template, and Lipofectamine 2000 was employed to transfect two recombinant vectors into 293T cells. A fluorescent microscope was used for Fluorescence observation, and Western blot was employed to examine the expression of the fusion protein. Double digestions and the agarose gel electrophoresis showed that target bands appeared at 4700 bp and 1000 bp, 4 800 bp and 1100 bp. No apparent frameshift mutation occurred as shown in the sequencing results. The fluorescent microscopy showed red and green phosphors; the Western blot results indicated protein expression at 65book=66,ebook=35kDa and 60 kDa. pDsRed1-N1-flag-pprI and pEGFP-N1-pprA were successfully constructed to express proteins for eukaryotic cells 293T in vitro. The results indicated that prokaryotic genes pprA and pprI could co-express proteins in eukaryotic cells successfully, and laid a foundation for the interaction and synergism of pprA, pprI, and their products in the regulation network of radiation verified by DR, enhancing the radiation resistance of eukaryotic cells.

KEY WORDSDeinococcus radiodurans, pprI, pprA, Eukaryotic cells, Lipofectamine 2000

Corresponding author:Ph.D. HE Shuya, professor, E-mail: heshuya8502@163.com

收稿日期：2016-01-25；修回2016-02-22

通讯作者：何淑雅，博士，教授，E-mail：heshuya8502@163.com

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.020206

中图分类号Q691，TL71