赵亚男，刘明，张玥，王彬，张玉冬，郝清智(山东中医药大学，济南5004；山东中医药大学附属医院)



糖尿病难愈性创面大鼠模型的建立

赵亚男1，刘明2，张玥2，王彬2，张玉冬2，郝清智2(1山东中医药大学，济南250014；2山东中医药大学附属医院)

摘要：目的 建立一种糖尿病难愈性创面大鼠模型。方法将34只雌性Wistar大鼠随机分为对照组和DM组各17只，适应性饲养1周后分别给予常规饲料及高脂高糖饲料喂养4周；DM组腹腔注射小剂量链脲佐菌素，对照组腹腔注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，4周后于两组大鼠背部制作直径约2.5 cm的圆形创面；创面造模后第3、7、14天，观察两组大鼠创面愈合情况并计算创面愈合率，HE染色法观察创面组织病理变化。结果DM组创面愈合率分别为5.21%±0.94%、31.70%±1.21%、62.20%±1.37%，对照组分别为20.87%±1.39%、49.99%±1.58%、91.60%±1.58%，两组同时点比较P均<0.05。与对照组相比，其创面组织中含有较少的炎性细胞、纤维母细胞及新生毛细血管。结论高脂高糖饲料饲养联合小剂量STZ注射制作2型糖尿病模型，维持高血糖4周后采用外科方法制作溃疡模型，可成功建立糖尿病难愈性创面模型。

关键词：糖尿病；溃疡；难愈性创面；动物模型

溃疡是糖尿病(DM)的常见并发症之一，常迁延难愈，严重影响患者的病情及生活质量[1,2]。因此，从动物模型研究其发病机制十分关键。目前国内多以大剂量注射链脲佐菌素(STZ)制备DM模型，并随即制备糖尿病溃疡(DU)模型[3,4]进行实验研究。但该方法存在两个问题，一是大剂量注射STZ会破坏大量胰腺细胞，引起胰岛素分泌下降，与DM病理过程及临床特征不符；二是血糖升高后尚未造成对皮肤的影响就进行溃疡造模，与DU病理过程不符。2014年6～9月，我们采用高脂高糖饲料喂养联合小剂量STZ腹腔注射的方法制作DM模型，并维持血糖长时间升高后再制作溃疡模型，以期成功模拟DM难愈性创面。

1材料与方法

1.1材料清洁级雌性Wistar大鼠34只，体质量160～180 g，购自山东大学动物实验中心；高脂高糖饲料(59%基础饲料+20%蔗糖+18%猪油+3%蛋黄)由北京科澳协力饲料有限公司加工制作；STZ(Sigma公司，美国)；罗氏血糖仪(德国)；超低温冰柜(725 Thermo Forma，美国)；石蜡切片机、光学显微镜照相系统(Lecia，德国)；CX40普通光学显微镜(Olympus，日本)；电热恒温干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；氯仿、无水乙醇、异丙醇、柠檬酸、柠檬酸钠等(天津广成化学试剂有限公司)。

1.2方法

1.2.1DM模型的建立 将大鼠随机分为对照组和DM组各17只，适应性饲养1周后，记录两组大鼠的体质量、进食量、饮水量、排泄量，并断尾取血测定大鼠随机血糖。对照组给予普通饲料，DM组给予高脂高糖饲料。两组均禁食12 h，DM组予1%的STZ溶液30 mg/kg单次腹腔注射，对照组注射等体积的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。注射后第3 天测随机血糖≥16.67 mmol/L为DM造模成功[5]，不成功的再次空腹12 h后注射1%的STZ溶液10 mg/kg。

1.2.2DU模型的建立 维持高血糖状态4周后，两组腹腔注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg，麻醉成功后背部脱毛，常规消毒；在背部用打孔器制作直径约2.5 cm的圆形创面，深至皮下[6]。DU造模时两组各死亡1只。将剩余大鼠各取15只用于后续实验。

1.2.3创面愈合情况观察DU造模后第0、3、7、14天，观察创面颜色、肿胀程度、渗液量等；用数码相机拍照，通过Photoshop软件记算创面面积[7]。创面愈合率=(创面初始面积-给药后第n天创面面积)/创面初始面积×100%。

1.2.4创面组织病理观察分别于DU造模后第3、7、14 天，每组各随机抽取5只；戊巴比妥钠麻醉成功后，采集创面及创周2 mm的组织；4%多聚甲醛固定后，常规制成组织切片；将石蜡切片脱蜡、水化后，行HE染色，观察创面组织病理变化。

2结果

2.1两组DU造模后不同时点创面愈合率比较见表1。

表1　两组DU造模后不同时点创面愈合率比较±s)

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.2两组创面组织病理变化在DU造模第3天，对照组创面可见炎症细胞浸润明显，有少量纤维母细胞及少量新生毛细血管；DM组创面有少量炎症细胞、纤维母细胞及新生毛细血管；第7 天，对照组创面可见肉芽组织，纤维母细胞生长活跃，新生毛细血管数量增加，有较多炎症细胞及少量胶原纤维；DM组创面可见炎症细胞浸润，有少量纤维母细胞及新生毛细血管，少量胶原纤维；第14 天，对照组创面可见新生表皮及肉芽组织，有少量炎细胞、纤维母细胞及毛细血管，可见较多胶原纤维；DM组创面可见新生表皮及肉芽组织，有少量炎细胞、纤维母细胞及毛细血管，可见胶原纤维。

3讨论

目前，DM动物造模主要有以下两种办法：一是采用STZ或四氧嘧啶大剂量注射，此法损伤大量胰腺细胞，导致胰岛素分泌显著下降，更倾向于1型DM的特点，且动物死亡率较高[8]。二是采用高脂高糖饲料喂养联合STZ注射[9，10]，高脂高糖喂养4周后大鼠出现明显的肥胖和胰岛素抵抗，而后一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg可成功制备2型DM模型[11～13]。因此，本研究采用第二种方法进行DM造模。

钟清玲[14]研究发现，在大鼠DM造模成功4周后皮肤组织可出现病理性改变，而DM所致皮肤改变在DU的发生中有重要地位。陆树良等[15]认为，DM患者表皮组织在未损伤的情况下已经存在组织学和细胞生物学行为的改变，并将此改变称为隐性损害，认为这一隐性损害可能是DM皮肤易损或创面形成后难以愈合的重要原因之一。因此，维持DM大鼠高血糖4周后再行创面造模较之血糖升高后随即造模更合理。本研究发现，维持高血糖4周后再行创面造模，DM组大鼠在造模后第3、7、14天创面愈合率均低于对照组，且创面组织的HE染色中表现出较少的炎性细胞、纤维母细胞及新生毛细血管等，因此本实验成功完成了DM难愈性创面的造模。所以，高脂高糖饲料饲养联合小剂量STZ注射制作T2DM模型，维持高血糖4周后采用外科方法制作溃疡模型，可成功模型DM溃疡的发病过程，并可作为DM难愈性创面的理想动物模型。

参考文献：

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(收稿日期：2015-12-21)

中图分类号：R332

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)14-0031-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.14.010

通信作者：刘明(E-mail: liuming404@163.com)

基金项目：山东省自然科学基金资助项目(ZR2012HL14)；山东省济南市青年科技明星计划(20120145)。