李燕 李静 杨洁 郝洪岭 王素云 李杰 袁军 王瑞仓

·论著·

多发性骨髓瘤骨髓病理检测血管内皮生长因子的表达情况

李燕 李静 杨洁 郝洪岭 王素云 李杰 袁军 王瑞仓

目的 探讨多发性骨髓瘤(MM)骨髓病理中，血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。方法 应用石蜡包埋的方法，经过免疫组化的相关方法对10例缺铁性贫血(对照组)的患者和40例MM患者(MM组)骨髓活检组织，检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达情况。结果 在本次研究中，VEGF在MM组和对照组的表达率比较，差异有统计学意义(P<0.05)。VEGF在多发性骨髓瘤不同分期中存在明显差异(P<0.05)。结论 在多发性骨髓瘤中，骨髓病理检测VEGF对于多发性骨髓瘤的诊断有重要意义，同时对于疾病的分期更有临床价值，VEGF在MM的发生、发展及预后有重要意义。

多发性骨髓瘤；骨髓活检塑料包埋切片；血管内皮生长因子

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的发病率较高，其中在恶性肿瘤中约占1%，在恶性血液病中约占10%，是一种血液科常见的恶性克隆性浆细胞疾病，至今不可治愈,可引起骨质破坏、贫血、肾功能衰竭等严重并发症[1]。研究显示多发性骨髓瘤的发病机制复杂，考虑与多种细胞因子、生长因子及其在内的多种相关因素相互作用有关，内皮细胞生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)，对骨髓瘤细胞的生长、增殖、浸润等有至关重要的作用，同时它也可以促进血管的形成及增加骨髓微血管密度。MM严重影响患者的生存质量，发病人群大部分为老年人，主要采取化疗或造血干细胞移植，但仍不能治愈此病，积极寻找更有效的检查手段及诊治方法，对早期有效的诊断及治疗至关重要[1]。我院对初诊的MM患者进行骨髓病理的检查，将患者的骨髓活检组织进行普通的石蜡包埋技术，并且使用免疫组化法对患者的血管内皮生长因子在MM患者的骨髓组织中的表达情况，同时观察了血管内皮生长因子的在不同分期的MM中相关表达关系，初步探讨血管内皮生长因子在MM的发病过程中能够起到积极作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取河北省人民医院在2013年5月至2014年8月间收治的MM患者40例为MM组，男25例，女15例；年龄40～86岁，平均年龄63岁。所有患者参考《血液病诊断及疗效标准》[2]，并根据Purie-salmen分期标准，通过骨髓细胞形态以及免疫固定电泳、全身骨扫描等明确诊断为MM，Ⅰ期10例，Ⅱ期16例，Ⅲ期14例。另外选取河北省人民医院同期缺铁性贫血10例为对照组，其中男6例，女4例。2组研究对象的一般资料差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 试剂 主要试剂为鼠抗人VEGF单克隆抗体，鼠抗人原始造血细胞的单克隆抗体CD34。免疫组化试剂盒为北京中山生物有限公司生产的免疫组化试剂盒，同时需要贮备烘片机、切片机、微波炉以及微量移液器。

1.3 实验方法 标本制备的过程需要使用B65-01骨髓活检针在患者的髂前或髂后使用上棘局麻后对患者的活检取材进行抽吸的处理，并需要进行4张涂片的制作。具体为5%～10%硝酸脱钙, 其脱钙的时间根据组织大小而定，脱钙后充分冲洗、脱水,石蜡包埋、切片,切片厚约3 μm,并进行HE染色及光镜观察。3%的过氧化氢进行10 min的孵育，并且将内源性的过氧化酶的活性进行消除，微波炉抗原修复的方式进行抗原的相关处理，滴加封闭用正常血清工作液的方式进行相应的处理，并在室温的环境下进行10 min左右的孵育，鼠抗人VEGF抗体以及鼠抗人原始造血细胞单克隆抗体CD34进行处理，在4℃的环境下进行处理，滴加通用型的生物素对相应的IgG进行标记；最后需要滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，在37℃环境下30 min，DAB显色。

1.4 判定标准 在本次研究中VEGF的评分需要按照染色强度以及阳性细胞的数量进行相应的评分[2]，其中染色强度的评分及显色度按细胞显色有无及深浅计分：没有任何染色：0分，弱染色(淡黄色)：1分，中染色(棕黄色)：2分，强染色(棕褐色)：3分。阳性细胞数量的评分方式为：没有任何阳性细胞：0分，阳性细胞数量低于25%：1分，阳性细胞数量为25%～50%：2分，阳性细胞数量高于50%：3分。将阳性细胞数量评分以及染色强度评分相加为VEGF评分。0分为阴性(-)，1～2分为低表达(+)，3～4分为中度表达(++)，5～6分为高表达(+++)。

1.5 统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VEGF在MM患者及缺铁性贫血患者中的表达 VEGF在MM患者及缺铁性贫血患者组织中表达阳性率及表达强度差异有统计学意义(χ2=3.951，P<0.05)。VEGF在MM中的表达阳性率明显高于对照组。见表1。

表1 VEGF在MM组与对照组患者骨髓组织中的表达 例

注：与对照组比较，*P<0.05

2.2 VEGF在不同分期MM患者中的表达 VEGF在不同分期的MM患者中表达比较差异有统计学意义(χ2=32.814,P<0.05)，VEGF的表达随MM恶性程度的增高而增高。见表2。

表2 VEGF在不同分期的MM患者中的表达 例

注：与Ⅰ期比较，*P<0.05；与Ⅱ期比较，#P<0.05

2.3 免疫组化结果 在对照组中，正常的骨髓中的VEGF仅仅是在血管内皮细胞中能够见到阳性表达的情况，而在正常的浆细胞中没有任何阳性表达。在MM患者中，浆细胞呈现出一种片状浸润以及结节状的浸润分布，同时VEGF在患者的骨髓瘤细胞中的胞浆呈现出阳性的表达，并且可见棕色颗粒，在部分的细胞膜中的表达形式为边缘为棕色的深环状，在患者的血管内皮细胞中能够见到阳性表达的情况。见图1～3。

3 讨论

对于MM而言，是一种较为常见的疾病，是一种恶性的浆细胞疾病，肿瘤细胞主要是起源于骨髓中的浆细胞，而浆细胞是一种B淋巴细胞发育到最终功能的细胞，因此我们可以发现，MM往往可以归结到B淋巴细胞的淋巴瘤周围，目前国际卫生组织也将MM归结于B细胞淋巴瘤中的一种，将其称之为浆细胞骨髓瘤或浆细胞瘤[3]。MM的特点是常有骨髓中异常浆细胞增生，并出现单克隆免疫球蛋白或M蛋白[4]。对于MM患者而言，往往会在发病初期出现骨骼变形、骨骼疼痛以及病理性骨折的情况，这主要是由于骨髓瘤细胞将患者的破骨细胞激活而发生的，同时患者也会出现出血以及贫血的症状，甚至有可能出现颅内出血的现象[5]。而患者在发病的中后期也极有可能会出现淋巴结、肝、脾以及肾脏的病变情况，而患者的神经系统在发病后往往会出现肢体瘫痪、昏迷、嗜睡、失明以及视力减退等情况，尤其是有较多患者在多发性骨髓瘤发病后会出现慢性肾功能衰竭、高钙血症、高尿酸血症以及高磷酸血症等情况[6]。而正是由于MM的特点，在实际的发病过程中会对患者造成极为严重的危害，甚至威胁到患者的生命。因此一种及时有效的检测MM的方式就显得极为重要。有研究显示，肿瘤血管的生成以及启动的过程往往是需要通过上调肿瘤的血管网，并且实现相关血管生成因子以及下调血管抑制因子来形成的[7]。

图1 正常骨髓组织VEGF(+)(免疫组化×200)

图2 MM患者的骨髓组织VEGF(++)(免疫组化×200)

图3 MM患者的骨髓组织VEGF(+++)(免疫组化×200)

在本次研究中，我们使用骨髓活检病理免疫组化的方法于MM患者的VEGF表达进行了研究。我们发现观察组的MM患者的骨髓涂片中的VEGF几乎没有表达，周慷等[8]研究显示，MM细胞会黏附在骨髓机制上，同时会形成一种阻碍抽吸的相关作用。而正是由于这样的情况，在实际的VEGF检验过程中，往往较难以发现VEGF的表达，而这种情况正是造成骨髓涂片中的骨髓瘤细胞数量明显少于活检切片的原因之一[9]。同时通过本次研究，也能够说明对于血管新生而言，最为重要的原因就是需要调控因子VEGF参与其中，血管新生[2]。而通过对这种机制进行研究，对治疗MM提供了理论依据[10]。

VEGF在大部分实体瘤及其他肿瘤细胞中有所表达，其中MM细胞及骨髓内皮细胞能够分泌VEGF、基质金属蛋白酶-2和金属蛋白酶-9(MMP-2、 MMP-9)，这些因子均与血管形成及疾病进展密切相关。VEGF基因是由8个外显子和7个内含子组成。编码VEGF的基因位于染色体6p21.3，全长14 kb。研究显示MM中，骨髓中血管形成的增加考虑原发病进展，提示预后不良。可作为评价预后的重要指标。国内外的研究显示，具有促进血管生成作用的一些细胞因子的过度表达影响MM的发生和发展[11-13]。目前针对MM的治疗方法主要为化疗及外周造血干细胞移植，治疗的目前主要为减缓不适症状、延长生存期及改善生活质量为主。其中化疗方案中，主要以沙利度胺、硼替佐米(Bortezomib)、马法兰、强的松等化疗方案为主，这些联合方案的应用已经在MM的患者取得了非常好的治疗效果[14]。

就目前而言，如果能早期获得完全缓解,对患者的长期生存有深远影响[15]，有较多种的抗MM的新药已经得到了关注，同时这些新药在实际的使用过程中能够较好的保证抑制血管新生的作用，甚至能够将其作为一种药物作用的主要靶点进行使用。如来那度胺，主要是能够将MM的细胞凋亡进行诱导，并通过这种形式将MM以及骨髓基质细胞的粘附进行相应的阻断。而通过这种形式，就能够较好的保证患者能够在实际的治疗过程中得到切实有效的治疗效果，并且将患者的骨髓血管新生进行较为明显的抑制，同时通过酪氨酸激酶的抑制作用，进一步抑制血管新生以及肿瘤增殖目前有研究显示，酪氨酸激酶的抑制剂能够较好的对患者的骨髓瘤细胞增殖进行抑制。这些作用能够抑制住VEGF以及血管新生，在临床上也取得了较好的效果，能够将患者的生存以及预后进行明显的改善。研究显示硼替佐米的作用机制可以通过抑制 DNA的修复来进一步抑制骨髓瘤细胞的增殖，同时体外实验目前也进一步显示如果硼替佐米联合阿霉素、马法兰等多种药物后,可加强对肿瘤细胞的抑制及清除作用[16]。

而在本次的研究过程中，患者的血清VEGF水平也显示能够有着较为满意的临床意义，与患者的治疗疗效及生存有关，在临床对MM患者进行治疗的过程中，值得推广应用。而患者的血清VEGF也与患者的实际年龄以及免疫分型和临床分期等没有显著的意义。

1 李欣,魏秀珍,刘晋玮,等.多发性骨髓瘤患者血清中VEGF水平的临床意义.中国实验血液学杂志,2014,22:108-111.

2 张之南主编.血液病诊断与疗效标准.第2版.北京:北京科学出版社,1998.373-380.

3 Seki R,Yamagishi SI,Matsui T,et al.Pigment epithelium-derived factor(PEDF)inhibits survival and proliferation of VEGF-exposed multiple myeloma cells through its anti-oxidative properties.Biochemical and Biophysical Research Communications,2013,431:693-697.

4 张蕾,陈世伦,陈文明,等.多发性骨髓瘤血管内皮生长因子和白细胞介素-6相互作用的研究.中华内科杂志,2005,44:85-88.

5 Claudia G,Gaetano V,Giuseppe V.Reduction of serum IGF-I levels in patients affected with Monoclonal Gammopathies of undetermined significance or Multiple Myeloma. Comparison with bFGF, VEGF gene mutation.Journal of Experimental & Clinical Cancer Research,2009,28:1671-1677.

6 姚军萍,汪兴洪,苏贵平,等.多发性骨髓瘤中缺氧诱导因子-1α和VEGF的表达及相关性研究.皖南医学院学报,2012,31:21-23.

7 Podar K,Tonon G,Sattler M,et al.The small-molecule VEGF receptor inhibitor pazopanib (GW786034B) targets both tumor and endothelial cells in multiple myeloma.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2006,103:19478-19483.

8 周慷,邓建川,娄世锋,等.多发性骨髓瘤survivin与VEGF表达的相关性及临床意义.肿瘤防治研究,2009,36:593-595.

9 Zhang L,Hu Y,Sun CY,et al.Lentiviral shRNA silencing of BDNF inhibits in vivo multiple myeloma growth and angiogenesis via down-regulated stroma-derived VEGF expression in the bone marrow milieu.Cancer science,2010,101:1117-1124.

10 Sun CY,Hu Y,Huang J,et al.Brain-derived neurotrophic factor induces proliferation, migration, and VEGF secretion in human multiple myeloma cells via activation of MEK-ERK and PI3K/AKT signaling.Tumour biology,2010,31:121-128.

11 Cohen KS．Angiogenesis and multiple myeloma: is there a role for angiogenic biomarkers in the context of autologous stem cell transplant Leuk Lymphoma， 2011,52:1173-1175．

12 Marisavljevic D，Markovic O，Cemerikic V，et al．Clinical and his-topathological study of angiogenesis in multiple myeloma．J BUON，2011,16:98-103．

13 Rana C，Sharma S，Agrawal V，et al． Bone marrow angiogenesis in multiple myeloma and its correlation with clinicopathological factors．Ann Hematol，2010,89:789-794．

14 Palumbo A, Ambrosini MT, Benevolo G, et al. Bortezomib,melphalan, prednisone and thalidomide for relapsed multiple myeloma. Blood,2007,109:2767-2772.

15 Attal M,Harousseau JL,Facon T,et al.Double autologous transplantation improves survivalof multiple myeloma patients: final analysis of a pro-spectiverandomized study of the “ Intergroupe Franco-phone du Myelome” (IFM 94).Blood,2002,100:7-10.

16 Mitsiades N,Mitsiades CS,Richardson PG,et al.The proteasome inhibitor PS -341 potentiates sensitivity of multiple myeloma cells to conventionalchemotherapeutic agents: therapeutic applications.Blood, 2003, 101: 2377-2380.

Expression of VEGF in multiple myeloma by means of bone marrow biopsy

LIYan*,LIJing,YANGJie*,etal.

*DepartmentofHematology,HebiProvincialPeople’sHospital,Hebei,Shijiazhuang050051,China

Objective To investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in multiple myeloma (MM) by means of bone marrow biopsy.Methods The expression levels of VEGF in bone marrow biopsy plastic embedding slices were detected by immunohistochemistry in 10 patients with iron deficiency anemia (control group) and 40 patients with MM (MM group).Results There were significant differences in the expression levels of VEGF between control group and MM group (P<0.05), moreover, there were significant differences in the expression levels of VEGF in MM group among different stages (P<0.05).Conclusion In multiple myeloma, the detection of expression levels of VEGF by means of pathological examination plays an important role in the diagnosis of MM,at the same time, which has significant clinical value in the pathological staging, pathogenesis,development and prognosis of MM.

multiple myeloma; bone marrow biopsy plastic embedding slice; vascular endothelial growth factor;expression

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.08.004

050051 石家庄市，河北省人民医院血液科(李燕、杨洁、郝洪岭、王素云、李杰、袁军、王瑞仓)；河北省中医院(李静)

R 733.3

A

1002-7386(2016)08-1136-04

2015-11-27)