李光荣，向成玉，杨　葵，刘靳波

(泸州医学院附属医院检验科，四川泸州 646000)



·论著·

医院分离耐碳青霉烯类药物鲍曼不动杆菌亲缘性的研究*1

李光荣，向成玉，杨葵，刘靳波△

(泸州医学院附属医院检验科，四川泸州 646000)

摘要:目的通过分析鲍曼不动杆菌(Ab)碳青霉烯类药物耐药和敏感菌株蛋白指纹图谱，了解碳青霉烯类药物耐药菌株亲缘性远近的临床应用价值。方法收集临床分离对碳青霉烯类药物耐药(22株)和敏感的Ab(18株)，利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)检测细菌蛋白质指纹图谱。采用Biomarker Wizard 3.1 软件分析碳青霉烯类药物耐药和敏感Ab相关差异蛋白，采用SPSS 19.0对差异蛋白进行聚类分析，追溯其临床感染的亲缘性。结果碳青霉烯类药物耐药与敏感的Ab菌株间蛋白质谱的表达差异有统计学意义(P<0.05)。聚类分析结果显示碳青霉烯类药物耐药Ab在院内的分布以A型为主，B型次之。结论聚类分析碳青霉烯类抗菌药物耐药的Ab蛋白质谱结果能够判断细菌亲缘关系远近，可为Ab感染和临床流行病学调查提供理论依据。

关键词:鲍曼不动杆菌；表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术；聚类分析；蛋白组学

鲍曼不动杆菌(Ab)大量存在于医疗环境中，常常可导致严重的院内感染，根据2013年CHINET数据显示，Ab的临床分离率已高于铜绿假单胞菌，位居非发酵菌临床分离率第一位[1]。碳青霉烯类药物是β-内酰胺类抗菌药物。近年来关于Ab耐碳青霉烯类抗菌药物的报道越来越多，患者一旦感染对碳青霉烯类药物耐药的Ab，常规抗菌药物基本治疗无效，患者往往死于无药可选[2]，因而如何治疗对碳青霉烯类抗菌药物耐药的Ab感染已经成为一个棘手的问题。随着表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)的广泛应用，蛋白组学在细菌耐药机制方面的应用也越来越多。本研究采用SELDI-TOF-MS技术检测对碳青霉烯类药物耐药的Ab株蛋白质表达谱，寻找碳青霉烯类药物耐药和敏感菌株之间的微量差异蛋白，通过对耐药菌株蛋白质指纹图谱进行聚类分析，探讨蛋白质组学在Ab亲缘性方面的价值，为院内Ab的感染和流行病学调查提供合理的依据。

1材料与方法

1.1菌株来源收集2011年1月至2013年4月本院临床分离的Ab 40株，剔除同一患者同一部位分离的菌株，其中碳青霉烯类药物耐药和敏感菌株分别为22株和18株。

1.2仪器与试剂MicroScan WalkAway 96全自动微生物鉴定/药敏测试系统及其配套试剂(德国西门子公司)，蛋白芯片时间质谱仪(PBS Ⅱ C)(Ciphergen Biosystems Inc),Au芯片(美国Bio-Rad公司)，低温台式高速离心机(5415D) (德国Eppendof公司)，芥子酸(美国Bio-Rad公司)，三氟乙酸、甲酸、胰岛素(美国Sigma公司)，亚胺培南和美罗培南药敏纸片(Oxoid公司)。

1.3方法

1.3.1细菌鉴定和药敏试验全部Ab均通过菌落形态，革兰染色后镜下形状及MicroScan WalkAway96全自动微生物鉴定/药敏测试系统获得。用亚胺培南、美罗培南药敏纸片对经仪器鉴定为亚胺培南耐药的Ab采用纸片扩散法(K-B法)进行验证。试验操作及药敏结果参照2010年美国临床和实验室标准化协会(CLSI)标准执行。所有Ab经检测鉴定后冻存于-80 ℃冰箱。药敏试验所用质控菌株为：大肠埃希菌ATCC25922、AbATCC19606。所有Ab菌株经鉴定后保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2细菌复苏与蛋白质提取将-80 ℃保存的40株Ab菌株常温下放置30 min后接种于巧克力平板，6.5% CO2，35 ℃，培养16～24 h分离出纯菌落。蛋白质的提取采用有机溶剂沉淀提取法，在低温下(4 ℃)进行操作[3-5]。

1.3.3质谱检测与分析严格按照PBS Ⅱ C型蛋白指纹图谱仪操作规程进行操作，经过样品混合液的制备、芯片活化和点样三个步骤。设置仪器运行条件：开始检测相对分子质量为1 000×103；检测最高限为100 000×103，优化限为2 000×103～20 000×103；开始激光强度为200；开始检测灵敏度为8；对结合在芯片表面的细菌蛋白质进行检测，质谱检测采用标准蛋白对照液(胰岛素，5 733.58)，二维内标法进行质量控制[6]。使用Ciphergen Protein Chip软件对蛋白质质谱数据进行分析，以质荷比((M/Z)为横坐标，以波峰强度(蛋白质相对浓度)为纵坐标绘制质谱图。BioMarker Wizard Software计算碳青霉烯类耐药和敏感菌株的蛋白质相对浓度，两组蛋白质峰值间比较采用t检验，筛选出差异蛋白(P<0.05)。

1.4统计学处理采用SPSS19.0统计软件进行聚类分析，根据数据特点选择离差平方和聚类法(也称Ward聚类法)。

2结果

2.1Ab蛋白质指纹图谱通过PBS Ⅱ C型蛋白指纹图谱仪检测结合在Au芯片上的Ab蛋白质，获得22株对碳青霉烯类药物耐药和18株对碳青霉烯类药物敏感的菌株，Ab蛋白质指纹图见图1。碳青霉烯类药物耐药与敏感菌株蛋白质比较，24个蛋白质峰差异有统计学意义(P<0.05)，从其中筛选质荷比分别为2 233.0、2 946.3、3 978.3、4 376.9、4 461.9、8 736.8的蛋白质进行聚类分析，见表1。

横轴：质荷比 AB33，碳青霉烯类药物耐药菌株；纵轴：峰强度 AB34,碳青霉烯类药物敏感菌株。

图1　　碳青霉烯类药物耐药与敏感Ab菌株蛋白指纹图谱

MEAN：均值；SD：标准差；M/Z：质荷比；R：碳青霉烯类药物耐药菌组；S：碳青霉烯类药物耐敏感组。

表2　　22株Ab聚类分析

续表2　　22株Ab聚类分析

2.2聚类分析结果22株碳青霉烯类药物耐药的Ab聚类分析见图2(见《国际检验医学杂志》网站主页“论文附件”)。横轴为标本之间的差异水平，纵轴代表聚类的标本。在差异水平值(欧氏距离)为10时，聚类分析结果将22株碳青霉烯类药物耐药的Ab分成A型、B型，从图2中可以看出碳青霉烯类药物耐药的Ab分布以A型为主，B型次之。A型又分为A1、A2两个亚型，并以A1为主，B型也分为B1、B2两个亚型，并以B2为主。22株Ab聚类分析见表2。

3讨论

近年来，在微生物研究方面用SELDI-TOF-MS蛋白芯片技术已获得越来越多有意义的成果。通过比较待测微生物和其他微生物的蛋白指纹图谱，可以找到待测微生物的特异蛋白，通过比较某种细菌耐药和敏感菌株的蛋白指纹图谱可以分析该种细菌对某种药物产生耐药的蛋白质组学原因。解春宝等[7]通过SELDI-TOF-MS技术建立铜绿假单胞菌蛋白指纹图谱诊断模型，快速鉴定铜绿假单胞菌。黄文芳等[8]通过SELDI-TOF-MS技术为血流感染病原菌的快速鉴定提供了新思路。

余琳等[9]对分离自呼吸重症监护病房(RICU)的多重耐药鲍曼不动杆菌(MDRAB)基因同源性进行流行病学分析，发现MDRAB曾在RICU有小范围的爆发流行。本研究采用SELDI-TOF-MS技术分析碳青霉烯类药物敏感与耐药Ab的蛋白表达，结果显示在相对分子质量为2 000×103～20 000×103范围内的蛋白质峰中有24个差异具有统计学意义(P<0.05)。将差异蛋白经过聚类分析显示碳青霉烯类药物耐药的Ab分布以A型为主，B型次之，A型分为A1和A2两个亚型，并以A1为主，B型也分为B1、B2。从聚类表中看到11和18号标本系数最小，距离最近，蛋白质数据最接近，被同时归为A1型，经查阅患者原始资料后发现2株Ab是在同一个月从同一科室患者痰液标本分离而得，说明2株Ab间亲缘最近，有可能来源于同一株Ab。8号和19号标本系数仅次于11和18号标本，蛋白质数据也很接近，聚类分析也被同时归为A2型，查阅患者原始资料，也是在同一个月从同一科室患者痰液标本分离而得，说明两次分离所得的细菌也可能来源于同一株Ab。以上结果说明，本院临床分离Ab曾在小范围内发生爆发流行，临床医生可通过本研究尽早了解本科室感染患者的互相感染，并采取措施预防和控制碳青霉烯类耐药菌株的流行。

本研究利用SELDI-TOF-MS技术初步筛选了碳青霉烯类药物敏感和耐药的Ab差异蛋白，但能否将此差异蛋白分离、纯化及鉴定，然后作为Ab碳青霉烯类药物耐药和敏感的蛋白标志物，用于临床的诊断与鉴别诊断的可行性尚需进一步研究。虽然本试验只是一个初步研究，但为Ab碳青霉烯类药物耐药和敏感菌株的诊断与鉴别诊断方面的研究提供了新的方法和思路。

综上所述，聚类分析碳青霉烯类抗菌药物耐药的Ab蛋白质谱结果能够判断细菌亲缘关系远近，可为Ab感染和临床流行病学调查提供理论依据。

参考文献

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[9]余琳，苏丹虹，江凤茹，等．多重耐药鲍曼不动杆菌耐药基因分析与同源性分析[J]．实用医学杂志，2013，42(12)：2018-2021．

The research on affinity of hospital separation carbapenems-resistant Acinetobacter*1

LiGuangrong,XiangChengyu,YangKui,LiuJinbo△

(DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege，Luzhou,Sichuan646000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the protein fingerprinting of carbapenems resistant and susceptible Acinetobacter baumannii (Ab) strains,investigate the clinical value of affinity distance in carbapenems resistant strains.MethodsA total of 22 carbapenems resistant Ab strains and 18 carbapenems susceptible Ab strains were collected,and bacterial protein fingerprinting was detected by surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS),differentially expressed proteins was analyzed by Biomarker Wizard 3.1.Cluster analysis of differential expressed proteins was conducted on SPSS 19.0.ResultsThe protein expression pattern of carbapenems resistant and sensitive Ab strains had significant difference(P<0.05).Cluster analysis showed carbapenems resistance Ab was given priority to with type A,followed by type B.ConclusionThe results of cluster analysis carbapenems resistance of Ab protein fingerprinting could determine the distance of affinity relationship of Ab.It could provide a theoretical basis for the infection and clinical epidemiology of Ab.

Key words:Acinetobacter baumannii;surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry；cluster analysis；proteomics

(收稿日期：2015-12-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.009

文献标识码：A

文章编号：1673-4130(2016)06-0740-03

基金项目：泸州医学院附属医院基金资助项目(14035)。

作者简介：李光荣，男，主管技师，主要从事微生物与生物化学检验研究。(△)通讯作者，E-mail：liujb7203@163.com。