李磊，李海畅，周贻兵，林野（.贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳550004；.贵阳市疾病预防控制中心，贵州贵阳55000）



液相色谱-串联质谱测定小麦粉中
11种真菌毒素

李磊1，李海畅2，周贻兵1，林野1
（1.贵州省疾病预防控制中心，贵州贵阳550004；2.贵阳市疾病预防控制中心，贵州贵阳550002）

摘要：建立小麦粉中11种真菌毒素的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品用乙腈-水溶液提取，经多功能净化柱PriboFast 100进行净化，采用XTerra MS C18色谱柱进行分离，以20 mmol/L乙酸铵溶液和乙腈梯度洗脱，利用超高效液相色谱-串联质谱进行分析。11种真菌毒素在测定浓度范围内线性关系良好，各组分相关系数R2>0.998，加标回收率范围72.4%～90.7%，方法精密度范围6.2%～11.8%，测定各组分真菌毒素定量限范围1.2μg/kg～2.0μg/kg。该方法前处理过程简洁、灵敏度高、重现性好，适用于小麦粉中11种真菌毒素的测定。

关键词：小麦粉；真菌毒素；超高效液相色谱-串联质谱

真菌毒素是霉菌在污染食品后所产生的有毒代谢物，是各种粮食及农副产品的主要污染物之一，据联合国粮农组织（FAO）报道世界上约有25 %的农作物受到真菌毒素的污染[1]。真菌毒素具有致癌及极强的细胞毒性，极易威胁到人体的健康[2-3]。我国是小麦制品的消耗大国，小麦运输储存过程中也极易受到真菌毒素的污染，目前已有报道在小麦制品中检出了黄曲霉毒素、呕吐毒素等真菌毒素[4]。

目前对于真菌毒素的检测主要方法有酶联免疫法[5]，气相色谱法[6]，高效液相色谱法[7-8]和液相色谱-串联质谱法[9-10]。酶联免疫法虽然设备要求简单，但是准确度上无法保证，大批量检测时容易出现假阳性结果；气相色谱法由于对分析物质要求具有低沸点且热稳定性好，所以在多组分真菌毒素的分析上应用受到了限制；高效液相色谱法稳定性较好，但是单一通过保留时间定性很难应用于多组分的真菌毒素的测定；高效液相色谱-串联质谱法能够克服上诉方法的缺点，具有高分离度、高准确度的特点。因此建立以乙腈-水溶液为提取液、多功能净化柱净化、超高效液相色谱-串联质谱同时检测小麦粉中11种真菌毒素的方法。

1　材料与方法

1.1主要仪器

TSQ Quantum三重四极杆串联质谱仪、戴安U3000超高效液相色谱仪：赛默飞世尔科技公司；多功能净化柱（型号PriboFast 100，2 mL）：Pribolab公司；离心机：德国Sigma公司；（SB25-12YDTD）超声水浴锅：宁波新芝生物科技公司；（UP1600）超纯水机：艾普科技公司。

1.2标准品及配置

黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2、伏马菌素B1、伏马菌素B2、伏马菌素B3、玉米赤霉烯酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、3-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇、15-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇（纯度≥92 %）：均购自ROMER公司。将上述标准溶液用乙腈配置为10 μg/mL的混合标准储备液，使用时用流动相初始比例配置标准曲线。

1.3样品前处理

称取粉碎并混合均匀后的样品5.0 g于50 mL离心管，加入提取液（乙腈∶水=60∶40，体积比）20 mL，超声辅助提取30 min，于10 000 r/min离心5 min，取上清液过多功能柱净化，准确移取净化后的样液2 mL于40℃下氮气吹干，使用流动相初始比例定容至1 mL，过0.45 μm微孔滤膜，用UPLC-MS/MS测定。

1.4超高效液相色谱及质谱条件

1.4.1超高效液相色谱条件

色谱柱：XTerra MS C18（150×2.1 mm，5 μm）色谱柱（Waters公司）；进样量：10μL；流动相：A为20mmol/L乙酸铵，B为乙腈；流速：0.3 mL/min；柱温：30℃。梯度进样程序见表1。

表1梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution conditions

1.4.2质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI±模式同时扫描）；多反应监测MRM模式；喷雾电压正离子模式3 500 V，负离子模式3 000 V；离子源温度280℃；脱溶剂温度300℃；鞘气（N2）40 arb；辅助气（N2）5 arb。质谱条件参数见表2。

表2质谱参数Table 2 Mass condition

2　结果与讨论

2.1多功能净化柱的选择

多功能净化柱相对于免疫亲和柱具有操作简便、成本较低的特点，但是不同的柱填料对小麦粉中不同种类的真菌毒素净化效力有所不同。在实际测试中发现PriboFast 100多功能净化柱对小麦粉中11种真菌毒素有良好的回收率且相对于免疫亲和柱具有成本低、能够同时净化小麦粉中多组分真菌毒素的特点。所以，笔者选择了以PriboFast 100多功能净化柱。

2.2色谱条件的优化

由于要同时兼顾质谱正负离子同时扫描，所以流动相选择了20 mmol/L的乙酸铵与乙腈梯度洗脱，试验中得到的锋型良好。11种真菌毒素标准溶液MRM色谱图见图1。

2.3质谱条件优化

本试验由于采用正负离子同时扫描，而不分段同时正负离子扫描会大大降低仪器灵敏度，所以采取了分时段采集模式，并配合XTerra MS C18色谱柱在保留时间完成正离子采集区域与负离子采集区域上的保留时间分离，相关质谱条件参数见表2。

2.4方法线性及检出限

将11种真菌毒素的混合标准溶液配置成系列浓度，以响应强度的峰面积为纵坐标，以质量浓度（μg/L）作为横坐标，绘制标准系列曲线，线性方程见表3。

将线性范围最低浓度点稀释并上机测定，以3倍信噪比（S/N）响应时所对应的浓度（μg/kg）作为检出限，以10倍信噪比（S/N）响应时所对应的浓度（μg/kg）作为定量限，结果见表3。

2.5方法回收率及精密度

图1 11种真菌毒素标准溶液MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of 11 mycotoxins

表3 11种真菌毒素的线性方程、相关系数、检出限及定量限Table 3 Linear equation，correlation coefficient，LOD and LOQ of 11 mycotoxins

选择空白小麦粉样品分高、中、低3个浓度进行加标回收试验，高、中、低组加标回收试验分别添加2、10、20 μg/kg质量浓度的混合标准物质，按照1.3所述样品前处理方法进行处理后测定加标回收率，并同时进行6次平行测定，考察方法精密度，结果见表4。

表4 11种真菌毒素加标回收率及精密度（n = 6）Table 4 Recoveries and RSD of 11 mycotoxins（n = 6）

试验结果显示各种真菌毒素的回收率范围为72.4 %～90.7 %，精密度范围为6.2 %～11.8 %。

3　结论

以小麦粉为研究对象，建立了超高效液相色谱串联质谱测定小麦粉中11种真菌毒素的方法。该方法测定11种真菌毒素线性关系良好，加标回收测定率范围为72.4 %～90.7 %，方法精密度范围为6.2 %～11.8 %，11种真菌毒素的定量限范围为1.2 μg/kg～2.0 μg/kg，样品前处理条件具有较高的基质干扰消除能力且准确度、灵敏度高，能够满足小麦粉中真菌毒素的检测要求。

参考文献：

[1]崔勇,李青,刘思洁,等.超高效液相色谱-串联质谱测定食品中4种真菌毒素残留量[J].中国卫生工程学, 2014, 13(1):46-48,51

[2]李慧芸,王军,张宝善.真菌毒素对食品的污染及防止措施[J].食品研究与开发, 2004, 25(3):26-30

[3]张宏宇,李振海,李舒梅.大米中常见的真菌毒素及其危害[J].中国中医药咨讯, 2010, 2(2):213

[4]张娟,李宗军,王远亮.大米中的真菌毒素及其生物脱毒技术的研究[J].农产品加工·学刊, 2009(11):4-7

[5]梁迪思,王飞,农云军.酶联免疫快速检测奶酪中AFM1检测方法的建立[J].农产品加工·学刊, 2014(9):39-41

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[10]朱群英,索莉莉,胡美华.液质联用同位素内标法同时测定小麦粉中7种真菌毒素[J].现代预防医学, 2014, 41(23):4362-4365, 4377收稿日期：2015-11-15

Determination of 11 Mycotoxins in Wheat Flour by Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry

LI Lei1，LI Hai-chang2，ZHOU Yi-bing1，LIN Ye1
（1. Guizhou Provincial Physical and Chemical Inspection of Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550004，Guizhou，China；2. Guiyang Provincial Center for Disease Control and Prevention，Guiyang 550002，Guizhou，China）

Abstract：Objects Establish method to detect the 11 kinds of mycotoxins in wheat flour by ultra performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry. Methods Samples were crushed and sieved extracted by aqueous acetonitrile，purified by multifunctional cleaning column PriboFast 100，separated by Xterra MS C18 chromatographic column，gradient eluted by 20 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile，and detected by ultra high performance liquid chromatography- tandem mass spectrometry. Results The 11 kinds of mycotoxins show good linear relationship between the concentration range，components correlation coefficient R2＞0.998，standard addition recovery range of 72.4 %-90.7 %，precision range 6.2 %-11.8 %，and LOQ components range 1.2 μg/kg-2.0 μg/kg. Conclusion The method shows high sensitivity，accurate，reproducible，which suitable for detection of 11 kinds of mycotoxins in wheat flour.

Key words：wheat flour；mycotoxins；UPLC-MS/MS

作者简介：李磊（1986—），男（汉），主管技师，硕士研究生，从事环境及食品卫生检验研究。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.040