王涛，李宏梁，*，张莉，舒静（.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安700；.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安70048）



一种简单有效检测牛乳中抗生素残留的方法

王涛1，李宏梁1，*，张莉2，舒静2
（1.陕西科技大学食品与生物工程学院，陕西西安710021；2.陕西省产品质量监督检验研究院，陕西西安710048）

摘要：根据当牛乳不含抗生素或抗生素浓度很低时，乳酸菌能发酵牛乳生成酸奶的原理，建立了乳酸菌抑制法来检测牛乳中抗生素残留。具体步骤为：称取约100 g纯牛乳/复原乳，90℃、10 min杀菌，冷却至（43±1）℃，接检测菌种3 %～4 %，并加入1mL溴甲酚紫指示剂，搅拌均匀，（43±1）℃下发酵。若发酵2.5 h发酵液仍为紫色，可初步判定为有抗奶；若发酵4h仍未凝乳，则确定为有抗奶，反之，则为无抗奶。该方法操作简单、乳酸菌剂购买方便且易保存，适于在企业推广。

关键词：牛乳；乳酸菌抑制法；抗生素残留

乳房炎是奶牛患病率最高的一种微生物感染性疾病，同时也是奶牛的第一杀手，因为感染严重的乳房炎很难治愈，奶牛就会当做肉牛被屠宰[1-2]。因此，小剂量的抗生素添加到饲料中预防乳房炎[3]，大剂量抗生素广泛用于治疗乳房炎[4]，人为将抗生素添加到鲜乳中防止腐败变质，这是牛乳中抗生素残留的主要原因[5-6]。牛乳中抗生素残留不仅严重影响发酵乳制品的生产加工（如酸奶、奶酪），造成经济损失[7-8]，而且长期饮用含抗生素的乳品后，抗生素在人体内不断积累，对健康有巨大危害[9]，可能导致人体发生过敏反应，肠道细菌产生一定的耐药性等[6，10-11]，更加严重的是对男性生殖功能存在潜在危害[12]，又如氯霉素，会导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症[13]。实践表明，凡是能发酵酸乳的乳源都是来自于未患乳房炎等疾病、未注射消炎针和疫苗的健康奶牛，反之，乳酸菌不能在有抗乳中发酵酸乳。因此，从理论上讲，采用乳酸菌抑制法能够有效鉴别鲜乳中是否含有抗生素[5]。直投式乳酸菌冻干发酵剂商品化程度高，来源广泛、价格不高，且保存方便。因此，本文就乳酸菌抑制法检验牛乳中抗生素残留进行研究，并利用该方法对市售纯牛乳和乳粉进行检测。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料

无抗纯牛乳：陕西银桥生物科技有限公司；乳酸菌YO-MIXTM207 LYO：丹尼斯克（中国）有限公司；溴甲酚紫[变色范围：6.8（紫色）～5.2（黄色）]、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠：天津市科密欧化学试剂有限公司；青霉素：哈药集团有限公司兽药厂，规格：2.4 g（400万单位）。

1.1.2仪器

HH-2型电热恒温水浴锅：北京科伟永兴仪器有限公司；SPX-150B（F）生化培养箱：上海瑞丰仪器仪表有限公司；SG2酸度计（pH计）：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，B203LEDR生物显微镜：重庆奥特光学仪器有限公司；MLS-3780不锈钢手提式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.2方法

1.2.1乳酸菌抑制法的建立

1.2.1.1检测菌种的制备

称取约150 g～200 g无抗脱脂牛乳于250 mL烧杯中，90℃、10 min杀菌后，将烧杯放入凉水中迅速冷却至50℃左右，自然冷却至（43±1）℃，撒入极少量乳酸菌干粉菌剂（能看见菌粉即可），无需搅拌，用无菌纸和棉线包扎封口，立即在（43±1）℃恒温箱中静置发酵6 h～7 h，肉眼可见凝固后取出，2℃～5℃冰箱保存备用[14]。每7 d重新制备1次。测定检测菌种活菌数方法参考GB 4789.35-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》[15]。

1.2.1.2乳酸菌抑制法最佳发酵条件的确定

称取约100 g无抗脱脂牛乳于250 mL烧杯中，90℃、10 min杀菌后，将烧杯放入凉水中迅速冷却至50℃左右，分别以接种量1 %、2 %、3 %、4 %、5 %；发酵温度37、40、43、46、49℃；发酵时间2.5、3、3.5、4、4.5 h为单因素，测定pH、酸度、观察凝乳情况、冷藏后酸乳质地及乳清析出量，从而确定最佳接种量、最佳发酵温度及最佳发酵时间。酸度测定方法参考GB 5413.34-2010《食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定》[16]。

1.2.1.3指示剂的选择

准确称取0.01 g青霉素，用无菌磷酸缓冲溶液（2.83 g磷酸二氢钠、1.36 g磷酸二氢钾、1 000 mL蒸馏水）稀释10 000倍配置成1 mg/kg储备液。用无抗脱脂乳稀释10倍配置成100 μg/kg的青霉素有抗奶样品，稀释100倍配置成10 μg/kg的青霉素有抗奶样品。以100 g无抗纯牛乳、10 μg/kg的青霉素有抗奶样品及100 μg/kg的青霉素有抗奶样品为原料，在乳酸菌抑制法最佳发酵条件和操作步骤下发酵，测定发酵时间1.5、2、2.5、3、3.5、4 h发酵液的pH，并观察凝乳情况。

1.2.2乳酸菌抑制法与GB法对市售纯牛乳和乳粉进行检测

对市售纯牛乳和乳粉进行采样，乳粉按质量比1∶10用蒸馏水复溶。用乳酸菌抑制法和GB/T 4789.27-2008《食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验》对样品进行检测[17]，验证乳酸菌抑制法的可行性和准确性。

2　结果与分析

2.1检测菌种的制备

检测菌种镜检图如图1所示，检测菌种活菌数测定图如图2所示。

图1检测菌种镜检图Fig.1 Microscopy of detection strain

图2检测菌种活菌数测定图Fig.2 Living bacteria of detection strain

通过显微镜观察发酵6 h～7 h、冷藏16 h后的检测菌种菌体生长形态，嗜热链球菌菌体呈圆形或者卵圆形，成对、短链排列；保加利亚乳杆菌菌体呈长杆状，单个或者成对、短链排列。嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌均处于生长旺盛期，而且无杂菌污染，测定检测菌种的活菌数为6.7×108cfu/g，综上所述，制备的菌种适合做检测菌种。

2.2乳酸菌抑制法最佳发酵条件的确定

单因素试验表明，接种量过小，凝乳质地软，接种量过大，凝乳质地硬，酸味大，接种量为3 %～4 %时，凝乳质地较好，乳清析出较少。发酵温度较低（如37℃）或较高（如49℃）时，乳酸菌生长繁殖受到抑制，产酸速度及产酸量降低，凝乳时间>8 h；当发酵温度为40℃或46℃时，产酸速度较快、凝乳质地较好，部分乳清析出；当发酵温度为43℃时，产酸速度快，凝乳质地好，无乳清析出，且口感好。当发酵时间不足（＜3 h）时，酸奶酸度不够，凝乳质地软、黏稠，无法形成凝乳；当发酵时间过长（>4.5 h）时，凝乳质地硬，酸味大；只有发酵时间合适（3.5 h～4.5 h）时，凝乳质地好，且无乳清析出。综上所述，乳酸菌抑制法发酵酸奶最佳接种量为3 %～4 %，最佳发酵温度为（43±1）℃，最佳发酵时间为3.5 h～4.5 h。

2.3指示剂的选择

抗生素对牛乳发酵过程中pH的影响如图3所示，抗生素对牛乳发酵过程中ΔpH的影响如图4所示。

图3抗生素对牛乳发酵过程中pH的影响Fig.3 Effect of antibiotic on pH of milk in fermentation process

图4抗生素对牛乳发酵过程中ΔpH的影响Fig.4 Effect of antibiotic on Δ pH of milk in fermentation process

由图3、图4可知，在发酵时间为2.5 h时，10 μg/kg的青霉素有抗奶的ΔpH（ΔpH＝pH有抗奶-pH无抗奶）最大，100 μg/kg的青霉素有抗奶在2 h～4 h范围内的ΔpH均大于0.8，可以看出，不管是高浓度有抗奶，还是低浓度有抗奶，发酵2.5 h的ΔpH均大于0.4，也就是说发酵2.5 h的pH能够很好反映有抗奶和无抗奶的差异，且无抗奶发酵2.5 h，pH下降到5.2以下，而有抗奶发酵2.5 h的pH在5.2以上，这一差异可以用溴甲酚紫指示剂直观反映。

综上所述，乳酸菌抑制法最佳发酵条件及操作步骤为：称取约100 g纯牛乳/复原乳待检样品于250 mL烧杯中，90℃、10 min杀菌后，将烧杯放入凉水中迅速冷却至50℃左右，自然冷却至（43±1）℃，接检测菌种3 %～4 %，并加入1mL溴甲酚紫指示剂，搅拌均匀，（43±1）℃恒温箱中静置发酵。判定方法为：若发酵2.5 h颜色仍为紫色，初步判定该纯牛乳/复原乳为有抗奶，若发酵4 h仍未凝乳或者凝乳不正常，则可确定该牛乳/复原乳为有抗乳；若发酵2.5 h颜色变为黄色，发酵4 h后凝乳均匀，无气泡，无分层，无乳清析出，色泽均匀，制作的酸奶口感柔和细腻，爽口润滑，酸度适中，乳香浓郁，则证明该牛乳/复原乳待检样品为无抗乳。

2.4乳酸菌抑制法与GB法对纯市售纯牛乳和乳粉的检测结果

乳酸菌抑制法与GB法对市售纯牛乳和乳粉的检测结果如表1所示。

表1乳酸菌抑制法与GB法对市售纯牛乳和乳粉的检测结果Table 1 Determination results of commercial pure milk and milk powder by lactic acid bacteria inhibition and GB method

表1是乳酸菌抑制法与GB/T 4789.27-2008对市售纯牛乳和乳粉的检测结果。结果表明，乳酸菌抑制法在2.5 h检测结果为阳性的样品中，纯牛乳有83.3 %的样品用国标法检测的结果也是阳性，乳粉有76.4 %的样品用国标法检测的结果也是阳性。乳酸菌抑制法在4 h未凝乳检测结果为阳性的样品，用国标法检测结果均为阳性。假设国标法检测的结果准确无误，那么虽然乳酸菌抑制法在发酵2.5 h以指示剂是否变色为判定法则的检测限低于发酵4 h以是否凝乳为判定法则的检测限，但以发酵2.5 h为判定法则的正确率为76.4 %～83.3 %，而以发酵4 h是否凝乳为判定法则的正确率为100 %。所以，发酵2.5 h根据显色反应可以作为初步判定方法，发酵4 h根据是否凝乳可以确定样品是否为无抗奶。

3　结论

本试验建立了乳酸菌抑制法来检测牛乳中抗生素的残留。具体步骤为：称取约100 g纯牛乳待检样品于250 mL烧杯中，90℃、10 min杀菌后，将烧杯放入凉水中迅速冷却至50℃左右，自然冷却至（43±1）℃，接检测菌种3 %～4 %，并加入1mL溴甲酚紫指示剂，搅拌均匀，（43±1）℃恒温箱中静置发酵。判定方法为：若发酵2.5 h颜色仍为紫色，初步判定该纯牛乳/复原乳为有抗奶，若发酵4 h仍未凝乳或者凝乳不正常，则可确定该纯牛乳/复原乳为有抗乳；若发酵2.5 h颜色变为黄色，发酵4 h后发生凝乳，则证明该纯牛乳/复原乳为无抗乳。

乳酸菌抑制法操作简单、成本低廉、菌种来源广泛且易于保存，能够一次性处理大批样品，是现有鉴别无抗奶和测定牛乳中兽药残留方法的有效补充，对提高乳制品质量、降低检测成本、完善乳品安全国家标准、促进我国乳品行业健康发展具有重要的现实意义。

参考文献：

[1]尹柏双,付连军,沙万里,等.我国奶牛乳房炎治疗技术研究进展[J].畜牧与兽医, 2013, 45(11): 101-103

[2]魏守军,牟瑞营.临床型奶牛乳房炎抗生素治疗方案[J].山东畜牧兽医, 2014(8): 52-53

[3] Cháfer-Pericás C, Maquieira Á, Puchades R. Fast screening methods to detect antibiotic residues in food samples[J]. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2010, 29(9): 1038-1049

[4] Chung H H, Lee J B, Chung Y H, et al. Analysis of sulfonamide and quinolone antibiotic residues in Korean milk using microbial assays and high performance liquid chromatography[J]. Food Chemistry, 2009, 113(1): 297-301

[5]樊璐,李宏梁,唐欣,等.乳酸菌发酵法检测鲜乳和乳粉中的两种抗生素残留[J].食品研究与开发, 2014(16): 91-93

[6]李惠,丁建江,李景芳.牛奶中抗生素残留的来源危害及防控[J].中国乳业, 2011, 114(6): 52-53

[7] Yamani M I, Al-Kurdi L M A, Haddadin M S Y, et al. A simple test for the detection of antibiotics and other chemical residues in exfarm milk[J]. Food Control, 1999, 10(1): 35-39

[8] Andrew S M, Moyes K M, Borm A A, et al. Factors associated with the risk of antibiotic residues and intramammary pathogen presence in milk from heifers administered prepartum intramammary antibiotic therapy[J]. Veterinary microbiology, 2009, 134(1): 150-156

[9] Van Asselt E D, van der Spiegel M, Noordam M Y, et al. Risk ranking of chemical hazards in food—A case study on antibiotics in the Netherlands[J]. Food Research International, 2013, 54(2): 1636-1642

[10] Le Breton M H, Savoy-Perroud M C, Diserens J M. Validation and comparison of the Copan Milk Test and Delvotest SP-NT for the detection of antimicrobials in milk[J]. Analytica chimica acta, 2007, 586(1): 280-283

[11] Dayan A D. Allergy to antimicrobial residues in food: assessment of the risk to man[J]. Veterinary microbiology, 1993, 35(3): 213-226

[12] Schlegel P N, Chang T S, Marshall F F. Antibiotics: potential hazards to male fertility[J]. Fertility and sterility, 1991, 55(2): 235-242

[13]吴晓丰,杨鹭花.氯霉素残留的危害及其检测方法[J].动物医学进展, 2004, 25(3): 41-43

[14]李宏梁,刘辉.发酵酸奶生产工艺优化[J].现代食品科技, 2008, 24(4): 360-362

[15]中华人民共和国卫生部.GB 4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验[S].北京:中国标准出版社, 2010

[16]中华人民共和国卫生部.GB 5413.34-2010食品安全国家标准乳和乳制品酸度的测定[S].北京:中国标准出版社, 2010

[17]中华人民共和国卫生部.GB/T 4789.27-2008食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验[S].北京:中国标准出版社, 2008

A Simple and Effective Method for the Detection of Antibiotics Residues in Milk

WANG Tao1，LI Hong-liang1，*，ZHANG Li2，SHU Jing2
（1. School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi′an 710021，Shaanxi，China；2. Shaanxi Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Xi'an 710048，Shaanxi，China）

Abstract：Lactic acid bacteria ferment milk makes yogurt when there is no，or very low amount of antibiotic in milk. The method of testing antibiotic in milk by lactic acid bacteria inhibition was established. Detail steps were：100 g milk or reconstituted was sterilized at 90℃，10 min，cooled to（43±1）℃，inoculated 3 %～4 %，and 1mL Chlorophenol Red solution added as an indicator，stirred well and incubated at（43±1）℃. If the color of fermentation broth was still purple after 2.5 h，we can preliminary judge the milk may contain antibotics；If it was did not curd after 4 h，we can confirm the milk contains antibotics，otherwise，it is no-antibotics milk. The operation of the method is simple，and lactic acid bacteria is easily available and preserved. Thus，the method is suitable for promotion in industry.

Key words：milk；lactic acid bacteria inhibition method；antibiotic residues

收稿日期：2015-11-27

*通信作者

作者简介：王涛（1990—），男（汉），在读研究生，研究方向：乳制品安全检测。

基金项目：陕西省质量技术监督系统科研项目（2015K123）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.038