杨红岩，才让卓玛，唐　煜，冯海霞，张　莹，蔡传勇，常运朝，车团结*

（1.甘肃省兽药饲料监察所，兰州　730030；2.甘肃省生物芯片工程实验室，兰州　730030；3.甘肃省功能基因组与分子诊断重点实验室，兰州　730030）



显色培养基在饲料沙门氏菌检测中的应用

杨红岩1，才让卓玛1，唐煜1，冯海霞2，张莹2，蔡传勇3，常运朝2，车团结3*

（1.甘肃省兽药饲料监察所，兰州730030；2.甘肃省生物芯片工程实验室，兰州730030；3.甘肃省功能基因组与分子诊断重点实验室，兰州730030）

摘要：研究旨在探讨沙门氏菌显色培养基在饲料微生物检测中的应用。利用氯化镁-孔雀绿增菌液和亚硒酸盐胱氨酸培养液增菌后，利用沙门氏菌显色培养基对60份饲料样品中的沙门氏菌进行检测。传统检测方法确定，饲料中沙门氏菌阳性份数为2（3.3%），氯化镁-孔雀绿增菌-沙门氏菌显色培养基和亚硒酸盐胱氨酸培养液-沙门氏菌显色培养基检测的阳性率与传统方法相当。经过PCR扩增阳性样品的fim Y基因测序鉴定，两例阳性样品均为沙门氏菌。沙门氏菌显色培养基用于饲料中沙门氏菌的检测，具有菌落形态典型、易于分辨的特点，适用于饲料中沙门氏菌的检测。

关键词：沙门氏菌；显色培养基；饲料检测

沙门氏菌是一种常见的人畜共患食源性致病菌，在全世界范围内广泛流行，给人类健康和畜牧业生产带来了巨大威胁。畜禽饲料中如果含沙门氏菌，菌量达到一定数目时，动物感染沙门氏菌可引起疾病甚至死亡，造成巨大的经济损失，阻碍畜牧业健康发展。因此，准确、快速地检测饲料中沙门氏菌，对于预防畜禽和人类沙门氏菌感染具有重要的意义。目前，饲料中沙门氏菌检测方法是依靠普通细菌培养基培养法，再将疑似菌落进行生化鉴定和血清学检测，操作繁琐、费事费力，而且敏感性和特异性均较差[ 1 ]。本文对沙门氏菌显色培养基在饲料沙门氏菌检验中的应用进行了初步研究。

1　试验材料

1.1饲料样品的采集

饲料样品来自甘肃省内58家养殖场（户）不同种类的60份配合饲料，其中鸡饲料14份，猪饲料27份，羊饲料4份，牛饲料15份。

1.2试验材料

缓冲蛋白胨水培养基、氯化镁-孔雀绿增菌液（RV）、亚硒酸盐胱氨酸培养液（SC）、酚红煌绿琼脂、DHL琼脂、营养琼脂、三糖铁琼脂（TSI）、尿素琼脂、赖氨酸脱羧试验培养基、β-半乳糖苷酶试剂，以上培养基均由本实验室自行配置；沙门氏菌显色培养基购自青岛海博；快速DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司。

2　试验方法

2.1沙门氏菌的分离培养

沙门氏菌的传统检测方法按GB/T13091-2002进行。沙门氏菌显色培养基的检测方法首先按照国家标准GB4789.4-2010进行待检样品的制备，并用缓冲蛋白胨水培养基预增菌，取预增菌培养物1 mL，接种于装有氯化镁-孔雀绿增菌液9 mL和亚硒酸盐胱氨酸培养液的培养管中，分别置于42℃培养和36℃培养24 h；分别取上述培养物100 μL接种于沙门氏菌显色培养平皿上，置于37℃培养24 h。

2.2沙门氏菌的鉴定

挑取沙门氏菌显色培养基上的阳性菌落，接种于SS液体培养基37℃培养16 h，取1 mL菌液提取基因组DNA，DNA提取参照试剂盒说明书进行，进行沙门氏菌保守基因片段的测序验证。

2.2.1沙门氏菌保守基因fimY的扩增

以沙门氏菌保守基因fimY设计引物，上游引物：5' GCCGGTAAACTACA CGATGA 3'，下游引物5' GAGTTACTGAACCAACAGC T 3'，扩增产物长度为526 bp[ 1 ]。最佳反应体系：10 X PCR buffer 2.5 μL，25 mmol·L- 1，MgCl21 μL，10 mmol·L- 1dNTP 0.5 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，Taq酶（2.5 U·μL-1）0.2 μL，灭菌三蒸水19.25 μL，最后加提取的模板溶液0.5 μL。反应条件：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s进行30个循环，最后72℃延伸10 min。

2.2.2扩增产物的测序鉴定

扩增的PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，切胶回收预期长度的基因片段，并与pMD18-T载体连接，操作步骤按说明书进行。连接产物转化到JM109感受态细胞中，通过蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定为阳性的菌落，送上海生工生物工程公司测序，获得的测序结果进行BLAST结果比对分析。

附表　饲料沙门氏菌检测结果

3　试验结果

3.1饲料中沙门氏菌的分离培养

饲料沙门氏菌检测结果见附表。

按照国家标准，挑选的阳性菌落经过生化鉴定和血清学鉴定，60个饲料样品中阳性样品为2份，阳性率为3.3%。沙门氏菌分离培养见图1。图1A为氯化镁-孔雀绿增菌培养基-沙门氏菌显色培养基；图1B为亚硒酸盐胱氨酸培养液沙门氏菌显色培养基，其检测的阳性样品与传统方法一致。

图1　沙门氏菌分离培养

3.2沙门氏菌保守基因fimY的扩增

根据沙门氏菌国家检验标准，氯化镁-孔雀绿增菌-沙门氏菌显色培养基和亚硒酸盐胱氨酸培养液沙门氏菌显色培养基分离到的沙门氏菌样品进行fimY基因PCR扩增，见图2。氯化镁-孔雀绿增菌-沙门氏菌显色培养基和亚硒酸盐胱氨酸培养液沙门氏菌显色培养基鉴定的两例样品中，fimY基因均扩增成功。

图2　fimY基因PCR扩增结果

3.3fimY基因的测序验证

扩增到的fimY基因与pMD18-T载体经重组菌液PCR鉴定阳性的菌落测序结果分析表明，均为沙门氏菌。

4　讨论

沙门氏菌传统检测方法是基于H2S和乳糖发酵试验进行的，但该类培养基特异性差、假阳性率高，而且费时费力[ 2 ]。因此，建立一种省时省力的可通过颜色显示或发出的荧光来鉴别待检细菌的方法，显得尤为必要。目前，已经有多种依据沙门氏菌生物学特征，如α-半乳糖苷酶活性、C8-酯酶活性等研制的显色培养[ 3 ]。也有大量关于显色培养基的灵敏度和特异性研究的报道[ 4-5 ]。

本试验利用沙门氏菌显色培养基对60例饲料中沙门氏菌进行检验，饲料样品首先利用增菌培养液预增菌，分别再用氯化镁-孔雀绿增菌液和亚硒酸盐胱氨酸培养液选择性增菌后，接种于沙门氏菌显色培养基上，生长的菌落直径较大、菌落数量比普通培养基多，而且可以通过菌落的颜色进行辨识，能够有效降低后续生化鉴定、血清学鉴定的工作量，具有简便、快速、准确的优点。

目前，以细菌分离培养、生化鉴定和血清学鉴定为基础的传统微生物分析检测技术仍然是细菌鉴定的金标准。本研究中，沙门氏菌显色培养基在沙门氏菌的检出率上与传统方法相当，但其能够有效抑制其他杂菌的生长，通过菌落颜色可以判断阳性菌落，减少了后续验证的工作量。由于本试验样品种类和数量有限，还需要进行大量样本的验证，进一步评价沙门氏菌显色培养基在饲料检测中的推广应用价值。随着微生物显色培养基的灵敏度和特异性的进一步提高，由于其特有的优势可能会逐渐被国际国内标准所采用[ 6- 7 ]。

[参考文献]

[ 1 ]孔繁德.沙门氏菌快速检测体系的建立与应用及其耐药性分析研究[D].南京:南京农业大学, 2006.

[ 2 ] Hyeon J Y, Park J H, Chon J W, et al. Evaluation of selective en⁃richment broths and chromogenic media for Salmonella detection in highly contaminated chicken carcasses[J]. Poultry Science, 2012, 91（5）: 1 222-1 226.

[ 3 ] Pal A, Marshall D L. Comparison of culture media for enrichment and isolation of Salmonella spp. from frozen Channel catfish and Vietnamese basa fillets[J]. Food Microbiology, 2009, 26（3）: 317-319.

[ 4 ] Manafi M. New developments in chromogenic and fluorogenic cul⁃ture media[J]. International Journal of Food Microbiology, 2000, 60 （2-3）: 205-218.

[ 5 ] Maciorowski K G, Herrera P, Jones F T, et al. Cultural and immu⁃nological detection methods for Salmonella spp. in animal feeds-a review[J]. Veterinary Research Communications, 2006, 30（2）: 127-137.

[ 6 ]杨小鹃,吴清平,张菊梅,等.显色培养基和传统XLD培养基检测沙门菌效果比较[J].卫生研究, 2013, 42（1）: 132-133.

[ 7 ]卢勉飞,蔡芷荷,吴清平,等.显色培养基快速检测沙门菌效果的研究[J].中国卫生检验杂志, 2008, 18（12）: 2 618-2 630.

Evaluation of Chromogenic Media for SalmonellaDetection in Animal Feeding Stuffs

YANG Hongyan1, CAI RANG Zhuoma1, TANG Yu1, FENG Haixia2, ZHANG Ying2, CAI Chuanyong3, CHANG Yunchao2, CHE Tuanjie3*

（1. Control Institute of Feed and Pharmaceuticals, Lanzhou 730000, China; 2. Key Laboratory of Bio-array of Gansu Province, Lanzhou 730000, China; 3. Key Laboratory of Function Genome and Molecular Detection of Gansu Province, Lanzhou 730000, China）

Abstract:This trial evaluated chromogenic Salmonella agar in comparison with a conventional culture method in detecting Salmonella in feed in the presence of Salmonella spp. The culture method for the detection of Salmonel⁃la rely on pre-enrichment in Rappaport-Vassiliadis soy broth(RVS) or Selenite cystine medium(SC). After enrich⁃ment, we compared chromogenic agar with a classic conventional culture method for animal feeding stuffs. Salmonel⁃la were isolated from 2 of the 60 samples(3.3%) with conventional culture methods and chromogenic agar. The posi⁃tive samples were confirmed by PCR method amplifying and sequencing the fim Y gene of Salmonella spp. The results indicated that the enrichment broths combingchromogenic Salmonella agar had agreat effect on rapid visual⁃ization of Salmonella spp. colonies for surveillance of Salmonella infections in animal feedingstuffs.

Key words:Salmonella; chromogenic medium; feedingdetection

作者简介：杨红岩（1966-），女，藏族，甘肃迭部人，高级兽医师，主要从事动物产品质量安全及饲料安全检测。

收稿日期：2015-12-11

中图分类号：S852.6；S816

文献标志码：A

文章编号：1001-0084（2016）02-0043-03