阎彦霏，苏秀敏，杨秋萍，陈 进，秦明倩，施春雷，史贤明，陈 佳，杨保伟*

（1 西北农林科技大学食品科学与工程学院 陕西杨凌 712100 2 上海交通大学农业与生物学院 上海 200240 3 石家庄学院化工学院 石家庄 050035）

沙门氏菌（Salmonella）是常见的肠道致病菌，其导致的食源性疾病爆发与食用畜禽产品关联较多，引发的肠胃炎、败血症等疾病对人类健康和社会经济造成很大的影响[1-4]。沙门氏菌对人类的感染主要取决于其血清型和食用者的身体状况。有研究表明，不同血清型沙门氏菌在我国各省份不同食品中检出程度不同。胡豫杰等[5]对我国6 省份零售整鸡中沙门菌血清型分布研究显示，肠炎沙门氏菌、印第安纳沙门氏菌和婴儿沙门氏菌为优势血清型。钟舒红等[6]、刘雪杰等[7]对广西省畜禽产品源和福建省食源性沙门氏菌的研究发现，鼠伤寒沙门氏菌、德尔卑沙门氏菌和肠炎沙门氏菌亦为主要血清型。由于肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌等均可产生耐热的肠毒素，不仅可导致宿主产生腹泻等食源性疾病，而且会引发其它更为严重的症状[3，8-10]。这些沙门氏菌常在动物性食品[5，11-13]和食品环境[5，14]被检出，对食品安全带来极大威胁。

沙门氏菌在食品中流行状况不同，不同血清型的沙门氏菌及菌株个体在宿主体内代谢各异[3]，其同源关系及来源追溯可通过基因分型的方法进行。作为沙门氏菌基因型分析的“黄金标准”，脉冲场凝胶电泳（Pulse field gel electrophoresis，PFGE）技术在国内外被应用于各种病原菌的分子分型[15-19]。开展鸡肉源沙门氏菌的血清型和基因型，可丰富我国食源性致病菌分子流行病学特性数据库，为预警和控制食源性疾病爆发、保障食品安全提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 沙门氏菌共399 株，分离于采集自广东省、广西省、福建省和上海市的576 份零售鸡肉样品，菌株的分离和鉴定参考Cui 等[20]的方法进行。布伦登卢普沙门氏菌（Salmonella Braenderup）H9812 为中国食品药品检定研究院惠赠。

1.1.2 培养基和试剂 Luria-Bertani（LB）营养琼脂、胰酪胨大豆琼脂（Trypticase Soy Agar；TSA）和半固体营养琼脂，北京陆桥技术股份有限公司；PFGE 专用琼脂糖（SeaKem Gold Agarose），美国Cambrex Bio Science 公司；十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、三羟甲基氨基甲烷盐酸（Tris-Hcl）、乙二胺四乙酸（Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟（Phenylmethylsulfonyl Fluoride，PMSF） 等均为分析纯，Sigma 公司；硼酸和氯化钠均为分析纯，西安化学试剂厂；蛋白酶K 和限制性内切酶XbaI，宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；Xba I 酶切缓冲液、蛋白酶K 缓冲液和牛血清蛋白（BSA）为商品酶自带；细胞悬浮液（Cell Suspension Buffer；CSB）、细胞裂解液（Cell Lysis Buffer；CLB）、TE 缓冲液和0.5×TBE 电泳缓冲液均自行配制。

1.1.3 沙门氏菌分型用血清 抗血清为泰国S &A 公司的沙门氏菌诊断血清，包括沙门氏菌O 多价抗血清（Salmonella O Polyvalent Antisera），O群抗血清（Salmonella O Group Antisera），O 单因子抗血清（Salmonella O Factor Antisera），H 多价抗血清（Salmonella H Polyvalent Antisera），H 相抗血清（Salmonella H phase Antisera），H 单因子抗血清（Salmonella H Factor Antisera）和H 抗原诱导相抗血清（Salmonella H for Phase Inversion Antisera）。

1.2 血清型鉴定

鉴定按照泰国S&A 公司提供的沙门氏菌诊断血清操作步骤和说明进行，查阅S&A 公司沙门氏菌抗血清诊断附录和沙门氏菌检验国家标准（GB/T 4789.4-2016），根据测定得到的抗原式，确定沙门氏菌的血清型。

1.3 PFGE

PFGE 分型按照美国疾病预防控制中心推荐的分型方法进行。电泳凝胶使用溴化乙锭染色后成像，用MINITAB 16 对数据进行统计学分析（P＜0.05 表示差异显著），并用BioNumerics 软件聚类分析，确定沙门氏菌基因型及同源关系。布伦登卢普沙门氏菌H9812 为分型标准质控菌。

2 结果和分析

2.1 零售鸡肉中沙门氏菌血清型分布

399 株沙门氏菌共检出47 种血清型（表1）。检出率最高的为肠炎沙门氏菌（17.04%），但与鼠伤寒沙门氏菌（16.04%） 和印第安纳沙门氏菌（14.04%）的检出率间无显著性差异。该3 种血清型沙门氏菌的检出率显著高于汤卜逊沙门氏菌（9.02%）和阿贡纳沙门氏菌（7.52%）。肠炎沙门氏菌在福建省、上海市和广西省的检出率显著高于广东省，鼠伤寒沙门氏菌、汤卜逊沙门氏菌和阿贡纳沙门氏菌的检出率在4 省份间无显著性差异（表1）。

表1 零售鸡肉中不同血清型沙门氏菌的检出率Table 1 Detection rate Salmonella serovars in retail chickens

（续表1）

广东省零售鸡肉源沙门氏菌中共检出22 种血清型，主要为鼠伤寒沙门氏菌（20.00%）、阿贡纳沙门氏菌（10.77%）、印第安纳沙门氏菌和汤卜逊沙门氏菌（9.23%）、罗森沙门氏菌（8.46%）、肠炎沙门氏菌（6.15%）和杜塞尔多夫沙门氏菌（3.85%）等。上海市共检出13 种血清型，以印第安纳沙门氏菌（26.83%）最为常见，其次分别为肠炎沙门氏菌（20.73%）、鼠伤寒沙门氏菌（15.85%）、汤卜逊沙门氏菌（10.98%）和阿贡纳沙门氏菌（3.66%）等。福建省共检出15 种血清型，以肠炎沙门氏菌（29.27%）最为常见，其次分别为印第安纳沙门氏菌（17.07%）、鼠伤寒沙门氏菌（14.63%）、阿贡纳沙门氏菌（8.54%）、汤卜逊沙门氏菌（6.10%）、爱丁堡沙门氏菌和塞内加尔沙门氏菌（3.66%，3.66%）等。广西省共检出20 种血清型，较常见的血清型为肠炎沙门氏菌（18.10%）、鼠伤寒沙门氏菌（12.38%）、汤卜逊沙门氏菌（9.52%）、印第安纳沙门氏菌（7.62%）和阿贡纳沙门氏菌（5.71%）等。

4 省市检出的鸡肉源沙门氏菌优势血清型各不相同，上海市为印第安纳沙门氏菌，广东省为鼠伤寒沙门氏菌，福建省和广西省为肠炎沙门氏菌。德尔卑沙门氏菌在广东省、福建省和广西省都有不同程度的检出，但却未在上海市检出。罗森沙门氏菌和杜塞尔多夫沙门氏菌在广东省和广西省均有检出，却未在上海市和福建省检出。由此可见，沙门氏菌血清型分布具有明显的地域性。

2.2 零售鸡肉源沙门氏菌的基因型

399 株沙门氏菌中有32 株XbaⅠ酶切、PFGE分型不成功。367 株菌分型、聚类后，可被分为13大簇和219 个基因型（具体聚类结果未展示）。同一血清型的沙门氏菌分型后基本处于同一大簇或其相邻簇中。部分同一血清型的菌株分型后DNA带谱差异较大，聚类后分布于不同大簇，表明分离株亲缘关系较远或其基因型本身就存在明显的多样性。

一些源于不同地区、血清型不同的菌株PFGE分型后DNA 带谱具有较高相似度，聚类后处于同一簇中，表明具有该基因型的菌株在不同地域流行比较广泛，虽然血清型不同，但在自然界演化过程中可能有着较近的亲源关系。

2.3 常见血清型沙门氏菌的基因型

2.3.1 肠炎沙门氏菌的基因型 65 株肠炎沙门氏菌经XbaⅠ酶切、PFGE 分型、结果聚类后共呈现出38 种不同的基因型，所有菌株的基因同源性为96%。尽管这些肠炎沙门氏分离于不同时间、地点和零售鸡肉样品，但却具有较高的基因同源性，表明这些来源各异的肠炎沙门氏菌在进化上可能为某一克隆的沙门氏菌演变而来，也可能是采样期间在这几个省市零售鸡肉中流行的肠炎沙门氏菌种类，表明肠炎沙门氏菌对食品造成的污染在时间和空间上具有立体性及普遍性特征。

2.3.2 印第安纳沙门氏菌的基因型 54 株印第安纳沙门氏菌使用XbaⅠ酶切、PFGE 分型并聚类分析后共呈现出34 种基因型（图2）。所有菌株的同源性为97.5%。按98.2%的相似度可将其分为4个大簇，分别为IA、IB、IC、ID（图2），IC 簇内各菌株的同源性最高。菌株DNA 带谱相似性与采样地点、采样时间、鸡肉类型和贮存条件间没有明显的相关性，表明在这4 个不同省市零售鸡肉中印第安纳沙门氏菌的存在形式较为稳定，克隆体间差异不大。

图1 65 株零售鸡肉源肠炎沙门氏菌PFGE 基因型和聚类结果Fig.1 Phylogeny of PFGE patterns of 65 Salmonella serovar Enteritidis isolates from chicken

图2 54 株零售鸡肉源印第安纳沙门氏菌PFGE 基因型和聚类结果Fig.2 Phylogeny of PFGE patterns of 54 Salmonella serovar Indiana isolates from chicken

2.3.3 鼠伤寒沙门氏菌的基因型 58 株鼠伤寒沙门氏菌使用XbaⅠ酶切、PFGE 分型后共呈现出40 种不同的基因型（图3）。所有菌株的同源性为97%。按98%的相似度可将菌株分为3 大簇，分别为TA、TB 和TC。第3 簇TC 中的菌株在4 省均有检出，表明该基因型的菌株在零售鸡肉中流行状况较为稳定，其克隆体间差异不大。

图3 58 株零售鸡肉源鼠伤寒沙门氏菌PFGE 基因型和聚类结果Fig.3 Phylogeny of PFGE patterns of 58 Salmonella serovar Typhimurium isolates from chicken

2.2.4 汤卜逊沙门氏菌的基因型 20 株汤卜逊沙门氏菌经过XbaⅠ酶切、PFGE 分型后共呈现出18 种不同的基因型（图4）。所有菌株的同源性为97%。按99%的相似度可将其分为5 大簇，分别为ThA、ThB、ThC、ThD 和ThE。

图4 20 株零售鸡肉源汤卜逊沙门氏菌PFGE 基因型和聚类结果Fig.4 Phylogeny of PFGE patterns of 20 Salmonella serovar Thompson isolates from chicken

2.2.5 阿贡纳沙门氏菌的基因型 27 株阿贡纳沙门氏菌经过XbaⅠ酶切、PFGE 分型后共呈现出23 种基因型（图5）。按98%的相似度可将其分为4 大簇，分别为AA、AB、AC 和AD。

图5 27 株零售鸡肉源阿贡纳沙门氏菌PFGE 基因型和聚类结果Fig.5 Phylogeny of PFGE patterns of 27 Salmonella serovar Agona isolates from chicken

3 讨论

沙门氏菌在自然界分布广泛、血清型众多。在美国、欧洲和中国流行的主要是肠炎沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌[21-25]。王茂起[26]2001年在我国不同省市设点采样4 034 份，与刘雯静[27]2011年对我国6 个地区分离到的191 株沙门氏菌及李薇薇等[28]2018年研究我国4 省份肉鸡生产中沙门氏菌污染研究结果相同，优势血清型均为肠炎沙门氏菌[29-31]。本研究结果表明鸡肉源沙门氏菌最常见血清型同为肠炎沙门氏菌，符合我国近年来沙门氏菌在零售鸡肉中的流行规律。

各地区流行的沙门氏菌血清型和优势血清型不完全相同[13]。Qi 等[16]、高付敏等[32]和张庆贺[31]分别对上海市导致肠炎感染的主要沙门氏菌血清型、安徽省零售鸡肉中沙门氏菌污染情况及其血清型研究结果均显示肠炎沙门氏菌为主要流行血清型，表明肠炎沙门氏菌在我国零售食品中广泛存在，且容易导致消费者患病。与这些研究不同的是，谢爱蓉等[33]发现温州市生禽肉和生畜肉中的优势血清型为鼠伤寒沙门氏菌，而朱海华等[34]研究显示河南省零售鸡肉中主要为印第安纳沙门氏菌。这些不同的研究也显示出沙门氏菌在不同食品和不同地域间存在血清型差异性特征。

同一地区的流行沙门氏菌的优势血清型可能会随年份发生变化，但主要流行血清型种类却不会发生太多变化。Qi 等[16]研究发现，上海市1998-2006年从肠胃炎患者分离的565 株沙门氏菌主要为鼠伤寒沙门氏菌（21.59%） 和肠炎沙门氏菌（16.82%），胡海贇等[35]发现上海市2015-2017年腹泻病患儿中分离得到的196 株沙门氏菌仍以鼠伤寒沙门氏菌（40.3%） 为主，肠炎沙门氏菌（28.1%）次之。这与本研究从上海市零售食品中分离的沙门氏菌的主要血清型为肠炎沙门氏菌（20.73%）和鼠伤寒沙门氏菌（15.85%）结果比较吻合。

刘雪杰等[36]研究了2015-2018年福建省食源性疾病沙门氏菌感染情况，发现主要为鼠伤寒沙门氏菌（57.85%）和肠炎沙门氏菌（15.42%），而本研究从福建省的零售鸡肉中检出的优势血清型为肠炎沙门氏菌（29.27%） 和鼠伤寒沙门氏菌（14.63%）。虽然我们检测到的零售鸡肉中优势沙门氏菌血清型和导致感染的沙门氏菌血清型不完全一致，但流行型几乎相同。孟昭赫等[21]研究发现广东等4 省市零售鸡肉中比较常见的血清型为肠炎沙门氏菌（20.2%）、伤寒沙门氏菌（17.3%）、印第安纳沙门氏菌（15.6%）、汤卜逊沙门氏菌（10.8%）、阿贡纳沙门氏菌（8.4%）和罗森沙门氏菌（3.8%），与本研究检出的血清型结果比较一致。

虽然部分研究中采集的样品和本研究不同，但仍在相应的省市检出相同或相似的沙门氏菌血清型。诸葛石养等[37]在广西省农贸市场生鸡肉中检出的沙门氏菌以德尔卑血清型为主，肉鸡肛试沙门氏菌以肠炎血清型为主。钟舒红等[38]在广西省零售生鲜畜禽肉中检出的沙门氏菌主要为德尔卑（35.23%）和鼠伤寒沙门氏菌（11.93%），这些研究结果和本研究在相应的省市采集的零售鸡肉中沙门氏菌主要的血清型流行结果基本一致。

PFGE 分型过程不受菌株表型干扰，结果具有重复性好、分辨力强、易标准化、高准确性和稳定性等优点，对追溯传染源、确认传播链和发现新的流行菌株等方面具有重要作用[40-41]。本研究采用美国Pulse-Net 使用的PFGE 方法将399 株沙门氏菌分型后，同一血清型的菌株PFGE 分型后基本处于同一大簇，或其相邻簇中，且各省市均未显示出优势基因型的菌株。这与周正等[42]对我国食源性鼠伤寒沙门氏菌耐药谱及PFGE 分型研究的结果，与王晓泉等[43]对分离自我国江苏、上海、山东、陕西、河南和新疆等地的鸡白痢沙门氏菌，分离自新鲜鸡肉、猪肉和牛肉中的沙门氏菌及从事饮食行业人员肠道排泄物的沙门氏菌进行FFGE 分型后所得结论均比较一致，即沙门氏菌的PFGE 基因型既表现出地域间的多样性，也同时表现出地域内的高度同源性。

沙门氏菌是最常见的食源性致病菌之一，每年由沙门氏菌引发病例及致死病例数呈上升趋势[44]，开展沙门氏菌的分型研究对沙门氏菌的防控和风险评估，保障食品安全具有重要意义[45]。