张雅琪，邵诚臣，李成涛，2，赵子琴，谢建辉（.复旦大学基础医学院法医系，上海200032；2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063）



circRNA的研究进展及其法医学意义

张雅琪1，邵诚臣1，李成涛1，2，赵子琴1，谢建辉1
（1.复旦大学基础医学院法医系，上海200032；2.司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室，上海200063）

摘要：RNA在法医学领域中越来越受到重视，发展以RNA为基础的新生物标记在复杂案例分析中具有重要的意义。环形RNA（circular RNA，circRNA）是最近被广泛报道的一类非编码RNA，虽然其生成和表达调节机制目前尚未完全清楚，但现有的研究表明circRNA具有重要的生物学功能。circRNA具有细胞表达特异性，稳定性好且表达丰富等特点，使其在法医学应用中具有潜在意义。本文对circRNA的研究历程及生成调节机制、生物学属性及其生物学功能进行总结，希望能为相关研究和法医学应用提供参考。

关键词：法医遗传学；环形RNA；综述［文献类型］

组织细胞中含多种结构功能不同的RNA，如转移RNA（transfer RNA，tRNA）、信使RNA（messenger RNA，mRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA，rRNA）等。随着人们对RNA认识的深入，更多种类的RNA被发现，如微小RNA（microRNA，miRNA）、长链非编码RNA（long non－coding RNA，lncRNA）等。最近，环形RNA（circular RNA，circRNA）被广泛地报道［1］。在真核细胞中，根据circRNA的序列构成主要可分为外显子来源的circRNA、内含子来源的circRNA以及由外显子和内含子共同组成的circRNA三类，其中后两类circRNA目前研究较少［2］。本文对circRNA的研究现状进行总结，希望能为相关研究和应用提供参考。

1　概　述

1.1circRNA的发现和鉴定

circRNA是在mRNA前体（pre－mRNA）剪切过程中，外显子的5′端与3′端以反向剪切（backsplicing）形式形成3′，5′磷脂键连接的circRNA［3］。早在1991年，Nigro等［4］报道了一个肿瘤抑制候选基因DCC的转录子中含有乱序转录子（scrambled transcript）。随后，其他基因，如ETS－1、SRY等，也被发现存在类似的现象［5－6］。由于检测技术的限制，只有少量基因的circRNA被报道。随着测序技术的发展，特别是转录组测序技术（RNA－seq）及其分析技术的发展，细胞内大量的circRNA被发现。

由于circRNA缺少polyA尾，基于polyA的反转录策略能够导致circRNA转录子的丢失，因此对circRNA的检测通常采用随机引物进行反转录。同时，circRNA的5′端与3′端形成融合片段，因此可以利用这一特点进行分析。目前，对circRNA的检测主要有三种策略：（1）对全转录子测序后通过生物学信息分析circRNA；（2）去除含polyA的转录子后，进行测序并通过生物学信息分析circRNA；（3）RNase R酶去除线性RNA后进行测序，并通过生物学信息分析circRNA，这主要依赖于circRNA对RNase R酶不敏感。

由于circRNA的5′端与3′端形成融合片段，能够利用向外型引物检测circRNA，向外型引物只能扩增circRNA的cDNA，不能扩增线性mRNA的cDNA。同时，RNase R酶能够降解线性mRNA，而不能降解环状结构的circRNA，因此也能够使用RNase R酶消化线性mRNA后，使用向内型引物检测circRNA。

1.2circRNA的产生和调节机制

circRNA是一类非编码RNA，广泛存在于哺乳动物的各种不同类型的细胞中，但circRNA的生成机制和表达调节机制目前尚不完全清楚［3］。很长时间以来，circRNA被认为是pre－mRNA加工过程中选择性剪接产生的副产物。然而，仅很少的circRNA外显子被发现是选择性剪接过程中产生的外显子［2］。最近研究［7］发现，circRNA不是mRNA成熟过程中的副产物，而与mRNA一样，是pre－mRNA加工后的一个重要产物，并且生成circRNA的加工机制能与生成mRNA的加工机制形成竞争。同时，经典的剪切信号和剪切机制对于反向剪切来说也是必需的［8］。

在circRNA的生成过程中，外显子两侧的内含子内的反向互补序列可以促进外显子环化，如外显子两侧的反向互补的Alu元件［9－10］。一些蛋白质分子也在circRNA的产生过程中发挥着重要作用。盲肌基因（muscleblind－like，MBNL）能够与内含子上的muscleblind结合位点结合，当MBNL的表达水平升高时，能够促进circRNA的生成［7］。另外一个RNA编辑酶ADAR1也被表明参与circRNA的生成，沉默ADAR1的表达能够上调circRNA的表达［11］。最近，Conn等［12］发现颤抖基因（quaking，QKI）也能够调节circRNA的表达，QKI可结合外显子的侧翼序列，促进circRNA的生成；同时，外显子的侧翼序列插入QKI结合位点可导致外显子的环化。这些蛋白质分子都具有与内含子内特异序列结合的特性，其他能与内含子内序列特异结合的蛋白质分子是否参与circRNA的生成仍有待进一步研究。

1.3circRNA的功能

目前，对circRNA功能的研究较少，现有的研究表明，circRNA具有miRNA分子海绵、调控基因表达等功能，并与细胞功能和疾病具有密切作用。

少数circRNA富含miRNA的结合位点，能够发挥miRNA分子海绵的作用，从而阻断或降低miRNA对靶基因的抑制作用［13－14］。CDR1as长约1.5 kb，含有74个miR－7的结合位点，其中超过60个位点是保守的，因而CDR1as也被称为ciRS－7。SRY基因的circRNA长约1.2kb，含有16个miRNA－138的结合位点，能够竞争性结合miRNA－138，从而抑制miRNA－138的功能。然而，其他具有miRNA分子海绵的circRNA仍有待进一步研究。

部分circRNA的生成能够降低基因的mRNA表达水平。FMN基因在表达时能够生成一个含有翻译起始位点（ATG）的circRNA，当改变FMN基因序列抑制circRNA生成时，小鼠表现出肾发育不全的表型［15］。这类circRNA在生成时产生一个翻译起始位点缺失的线性mRNA，导致mRNA翻译失败，从而降低了蛋白质水平。当抑制这类circRNA形成时，能够升高基因的蛋白质表达水平，从而可能导致表型的异常。事实上，线性mRNA缺失circRNA含有的外显子也可能导致编码序列移位或蛋白质缺少重要的结构，从而调节蛋白质的表达水平或功能。

circRNA表达与细胞功能和疾病发展进程存在密切关系，如神经元活动、动脉粥样硬化等［16－19］。神经元内的circRNA主要位于突触中，在突触形成过程中，大量circRNA的表达水平在不断改变［16］。同时，在神经元活动时，circRNA的表达水平也在不断地调整。然而，circRNA在神经元功能调节中的功能和机制还有待进一步阐明。有研究［17］报道，ciRS－7在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）中表达水平降低，可能导致miRNA－7表达水平升高而降低miRNA－7靶基因的表达。此外，位于染色体区域9p21.3内的rs10757278位点与INK4/ARF表达和动脉粥样硬化风险具有明显的相关性，同时也与长链非编码ANRIL基因的circRNA（cANRIL）表达水平相关［18］。G/G基因型一般具有高cANRIL表达和低INK4/ARF表达，同时具有增高的动脉粥样硬化风险。最近，Li等［19］发现胃癌中Has_circ_002059表达明显下调，低表达的Has_circ_002059与胃癌的转移、TNM分期等明显相关，可能是胃癌诊断的一个潜在生物标记。

2　circRNA的属性及法医学意义

circRNA在细胞内表达非常丰富，含一个外显子或多个外显子，长度可以从100nt到4 kb［3］。circRNA主要定位于胞质中，这也与mRNA的定位类似，而不同于内含子来源的circRNA主要定位于细胞核内［10］。人类各种不同类型的细胞中都含有大量的circRNA，大部分基因的circRNA表达水平超过mRNA的10%，部分基因的circRNA表达水平甚至比mRNA高10倍以上［2］。circRNA的表达具有组织细胞特异性，不同类型细胞的circRNA表达谱不同［20］。由于circRNA具有组织细胞表达特异性，被认为是一种重要的调节分子。部分circRNA在物种间也有相对的保守性，如小鼠睾丸中的69种circRNA在人细胞中也存在［10］。同时，由于circRNA具有封闭环状结构，能够耐受核酸外切酶的水解，因此具有良好的稳定性，在细胞内比mRNA具有更长的半衰期［13］。

上述属性使得circRNA在法医学领域成为一类非常理想的候选生物标记分子。由于circRNA的稳定性和组织表达特异性，可以用于不同体液的鉴定，特别是对于陈旧的或降解的生物检材检测可能更具有优越性。在死亡时间推断中，circRNA的稳定性可能使其成为一种良好的分子内标，也可以通过circRNA的降解研究circRNA水平与死亡时间的关系。

3　研究展望

随着新一代高通量测序技术和生物学技术的不断进步，circRNA在不同组织细胞中的表达谱及组织特异性表达将进一步被揭示。随着研究的深入，circRNA的功能也将进一步被阐明。circRNA生成和表达调节机制将是circRNA研究的一个重点，以circRNA为基础的诊断和靶向治疗也将成为可能。重要的是，对于circRNA目前仍缺少统一命名的规则，新的命名规则，如使用circ加上基因名命名该基因的circRNA（如circDCC、circEST－1等），可以促进对circRNA的理解和更好地分类。circRNA的稳定性和组织（细胞）表达特异性等属性，在法医学上具有重要意义，将进一步促进法医学应用的发展。目前，对circRNA的研究还处于初始阶段，随着对circRNA研究的深入，circRNA将作为新的一类非编码RNA进一步揭开生命的奥秘。

参考文献：

［1］Kosik KS.Molecular biology：Circles reshape the RNA world［J］.Nature，2013，495（7441）：322-324.

［2］Salzman J，Gawad C，Wang PL，et al.Circular RNAs are the predominant transcript isoform from hundreds of human genes in diverse cell types［J］.PLoS One，2012，7（2）：e30733.

［3］Lasda E，Parker R.Circular RNAs：diversity of form and function［J］.RNA，2014，20（12）：1829-1842.

［4］Nigro JM，Cho KR，Fearon ER，et al.Scrambled Exons［J］.Cell，1991，64（3）：607-613.

［5］Cocquerelle C，Daubersies P，Majérus MA，et al. Splicing w ith inverted order of exons occurs proximal to large introns［J］.EMBO J，1992，11（3）：1095-1098.

［6］Capel B，Swain A，Nicolis S，et al.Circular transcripts of the testis-determ ining gene Sry in adult mouse testis［J］.Cell，1993，73（5）：1019-1030.

［7］Ashwal-Fluss R，Meyer M，Pamudurti NR，et al. circRNA biogenesis competes w ith pre-mRNA splicing［J］.Mol Cell，2014，56（1）：55-66.

［8］Starke S，Jost I，Rossbach O，et al.Exon circularization requires canonical splice signals［J］.Cell Rep，2015，10（1）：103-111.

［9］Zhang XO，Wang HB，Zhang Y，et al.Complementary sequence-mediated exon circularization［J］.Cell，2014，159（1）：134-147.

［10］Jeck WR，Sorrentino JA，Wang K，et al.Circular RNAs are abundant，conserved，and associated w ith ALU repeats［J］.RNA，2013，19（2）：141-157.

［11］Ivanov A，Memczak S，Wyler E，et al.Analysis of intron sequences reveals hallmarks of circular RNA biogenesis in animals［J］.Cell Rep，2015，10（2）：170-177.

［12］Conn SJ，Pillman KA，Toubia J，et al.The RNA binding protein quaking regulates formation of circRNAs［J］.Cell，2015，160（6）：1125-1134.

［13］Memczak S，Jens M，Elefsinioti A，et al.Circular RNAs are a large class of animal RNAs w ith regulatory potency［J］.Nature，2013，495（7441）：333-338.

［14］Hansen TB，Jensen T，Clausen BH，et al.Natural RNA circles function as efficientm icroRNA sponges［J］. Nature，2013，495（7441）：384-388.

［15］Chao CW，Chan DC，Kuo A，et al.The mouse form in（Fmn）gene：abundant circular RNA transcripts and gene-targeted deletion analysis［J］.Mol Med，1998，4（9）：614-628.

［16］You X，Vlatkovic I，Babic A，et al.Neural circular RNAs are derived from synaptic genes and regulated by development and plasticity［J］.Nat Neurosci，2015，18（4）：603-610.

［17］Lukiw WJ.Circular RNA（circRNA）in Alzheimer's disease（AD）［J］.Front Genet，2013，4：307.

［18］Burd CE，Jeck WR，Liu Y，et al.Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates w ith atherosclerosis risk［J］.PLoS Genet，2010，6（12）：e1001233.

［19］Li P，Chen S，Chen H，et al.Using circular RNA as a novel type of biomarker in the screening of gastric cancer［J］.Clin Chim Acta，2015，444：132-136.

［20］Salzman J，Chen RE，Olsen MN，et al.Cell-type specific features of circular RNA expression［J］.PLoS Genet，2013，9（9）：e1003777.

（本文编辑：李成涛）

·经验交流·

Research Progress of circRNA and Its Significance in Forensic Science

ZHANG Ya－qi1，SHAO Cheng－chen1，LI Cheng－tao1，2，ZHAO Zi－qin1，XIE Jian－hui1
（1.Department of Forensic Medicine，School of Basic Medical Sciences，Fudan University，Shanghai 200032，China；2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Institute of Forensic Science，Ministry of Justice，P.R.China，Shanghai 200063，China）

Abstract：RNA has received more attention in the field of forensic medicine and the development of the new biological markers based on RNA shows great significance in the analysis of complex cases. circular RNA（circRNA）is a kind of non－coding RNA which is w idely reported recently.Although the regulatory mechanisms of generation and expression are not fully clear，the existing research indicates that circRNA has important biological functions.CircRNA has a cell－type－specific expression w ith great stability and a high expression level，which makes it meaningful in forensic applications potentially.In this paper，the research progress，the generation and regulation of circRNA as well as its biological characteristics and functions are summarized，which w ill provide references for related studies and forensic applications.

Key words：forensic genetics；circRNA；review［publication type］

收稿日期：（2015－04－24）

通信作者：谢建辉，男，博士，副教授，博士研究生导师，主要从事法医遗传学研究；E－mail：jhxie＠fudan.edu.cn

作者简介：张雅琪（1989—），女，主要从事法医遗传学研究；E－mail：14211010071＠fudan.edu.cn

基金项目：国家自然科学基金资助项目（81222041、81571853）

文章编号：1004－5619（2016）02－0131－03

中图分类号：DF795.2

文献标志码：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.013