谢芳，赖铭裕，农云翠，苏婷

(1 广西医科大学第一附属医院，南宁530021；2 广西民族医院；3南宁市第二人民医院)



沉默GOLPH3基因对胃癌细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

谢芳1，赖铭裕1，农云翠2，苏婷3

(1 广西医科大学第一附属医院，南宁530021；2 广西民族医院；3南宁市第二人民医院)

摘要：目的观察特异性沉默高尔基体磷蛋白3(GOLPH3)基因对胃癌细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其机制。方法将人胃癌SGC-7901细胞随机分为3组，A、B组分别转染LV-GOLPH3-RNAi-1、无义链，C组不转染。转染72 h后，采用MTT法检测细胞增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡，Western blot法检测细胞GOLPH3、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)和mTOR。结果A组细胞增殖的OD值较B、C组低，细胞凋亡率(2.70%±0.11%)高于B组(0.42%±0.02%)和C组(0.31%±0.02%)，细胞GOLPH3、p-mTOR蛋白表达量较B、C组少，P均<0.05；B、C组间各指标比较，P均>0.05。结论沉默GOLPH3基因能抑制胃癌细胞增殖、促进胃癌细胞凋亡，其机制可能与下调mTOR信号通路中关键因子p-mTOR表达有关。

关键词：胃癌细胞；高尔基体磷蛋白3；小干扰核糖核酸；细胞增殖；细胞凋亡；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白

高尔基体磷蛋白3(GOLPH3)是一个新发现的癌基因[1]，在多种恶性肿瘤中存在过量表达[2～6]，能通过激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路促进肿瘤发生。有研究发现，GOLPH3在胃癌组织中高表达，提示其在胃癌发生、发展中起重要作用，但机制尚不清楚[7]。2013年3月～2015年1月，我们观察了特异性沉默GOLPH3基因对胃癌细胞增殖、凋亡的影响，为寻找胃癌的基因靶向治疗奠定实验基础。现报告如下。

1材料与方法

1.1材料人胃癌细胞株SGC-7901购自中国科学院上海细胞所；本实验室共设计3条针对GOLPH3基因的siRNA序列，选择其中沉默效率最高的LV-GOLPH3-RNAi-1进行实验；胎牛血清(FBS)购自杭州四季青生物工程有限公司；RPMI 1640培养基购自Hyclone公司；逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂均购自日本TaKaRa公司；MTT购自北京索来宝生物科技有限公司；Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒购自美国BD公司；GOLPH3兔抗人多克隆抗体购自美国Abcam公司、 mTOR和磷酸化mTOR(p-mTOR)兔抗人单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养与分组处理将SGC-7901置于含10% FBS的RPMI 1640培养基中，37 ℃ 5% CO2条件下培养，常规更换培养液、传代。取第5代细胞，随机分为3组。A、B组分别采用Lipofectamine 2000转染LV-GOLPH3-RNAi-1、无义链，C组不转染。A、B组细胞均转染72 h。

1.2.2细胞增殖观察采用MTT法。收集各组细胞，以5×103/孔接种于96孔板，每组设5个复孔。于接种后24、48、72、96、120、144、168 h在培养基中加入20 μL的 MTT溶液，使MTT终浓度为0.5 mg/mL，置于培养箱中继续培养4 h。吸净上清后，加入等体积DMSO，置于摇床振荡10 min；酶标仪检测492 nm波长处各孔光密度(OD)值，以此表示细胞增殖能力。

1.2.3细胞凋亡观察收集各组细胞，按照Annexin V-PE/7-AAD凋亡试剂盒使用说明书操作，采用流式细胞术检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.2.4细胞GOLPH3、mTOR和p-mTOR蛋白检测采用Western blot法。收集各组细胞，用RIPA及PMSF裂解液提取各组细胞总蛋白；将总蛋白液及上样缓冲液按5∶1混合，沸水煮5 min变性后制成蛋白质样品；配制5%浓缩胶和10%分离胶，将等量样品加入凝胶孔道中电泳；100 mA稳流状态下转膜,将蛋白转至聚偏二氟乙烯膜；用5%蛋白封闭液室温于摇床上摇动封闭1 h，用TBST漂洗后置于一抗(GOLPH3、β-actin均1∶10 000稀释) 中4 ℃孵育过夜；再次TBST漂洗后加入稀释的山羊抗兔二抗(1∶5 000) ，室温置于摇床上孵育1 h，TBST洗膜(5次×5 min)后进行显影定影。以目的蛋白与β-actin条带的OD比值表示目的蛋白表达量。

2结果

2.1各组细胞增殖能力比较A组各时点细胞增殖较B、C组缓慢(P均<0.05)，而B、C组比较无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1　各组细胞增殖能力比较±s)

注：与C组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。2.2各组细胞凋亡率比较A组细胞凋亡率(2.70%±0.11%)高于B组(0.42%±0.02%)和C组(0.31%±0.02%)，P均<0.05；B、C组间比较，P>0.05。

2.3各组GOLPH3、mTOR和p-mTOR蛋白表达比较 见表2。

表2　各组GOLPH3、mTOR和p-mTOR蛋白表达

注：与C组比较，*P<0.05；与B组比较，#P<0.05。

3讨论

GOLPH3蛋白是一种高度保守的高尔基体基质蛋白，相对分子量为34 kD，其编码基因位于人类染色体5p13区域上。2000年，Wu等[8]首次发现位于高尔基体反面网络结构(GN)的GOLPH3。GOLPH3与高尔基体正常形态保持有关，并参与蛋白质的加工、修饰和转运：GOLPH3与磷脂酰肌醇-4-磷酸结合[ptdlns(4)p]，影响高尔基体的分泌和转运功能[9]；GOLPH3与糖基酰转移酶的N末端相连接，使蛋白质锚定于高尔基体上，从而影响蛋白质的糖基化修饰[10,11]；GOLPH3与肌球蛋白MY018A、ptdlns(4)p及细胞骨架肌动蛋白F-actin相连组成复合体，参与高尔基体正常形态的保持和囊泡转运[12]。有研究者发现，将横纹肌肉瘤细胞中的GOLPH3基因敲除后可抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖。体外实验发现，慢病毒介导的GOLPH3沉默有明显的抗食管鳞癌作用，是治疗食管癌的潜在分子靶点[13]。Hu等[7]研究发现，GOLPH3表达与胃癌的肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、远处转移、病理分级等显著相关，提示GOLPH3过表达有可能是胃癌预后不良的独立预测指标。

RNAi技术是利用外源性或内源性的双链RNA(dsRNA)特异性的将细胞内的同源mRNA降解为21～23个核苷酸的小片段，从而导致靶基因沉默的技术，具有特异性、高效性等特点，目前广泛应用于恶性肿瘤的基因治疗、病毒感染性疾病等的研究[14]。本研究结果表明，RNAi沉默GOLPH3表达能显著抑制胃癌细胞SGC-7901的增殖，但机制尚不清楚。

细胞增殖、凋亡受多种信号通路的调控,信号传导系统异常可引起细胞增殖、凋亡改变，甚至恶变[15]。Scott等[1]认为，GOLPH3能通过激活mTOR信号通路诱导正常细胞发生转化，促使细胞增殖、分化过程失去平衡，最终导致细胞恶性转化以及肿瘤发生，并增加肿瘤细胞对雷帕霉素的敏感性。国内有研究发现，PI3K/mTOR双重抑制剂PF-04691502能通过阻滞细胞周期来抑制SGC-7901细胞增殖[16]。本研究结果表明，抑制GOLPH3基因可下调mTOR信号转导通路中关键因子p-mTOR的表达，GOLPH3可能是通过mTOR信号转导通路影响胃癌细胞的增殖、凋亡。因此，GOLPH3可作为潜在靶点在胃癌早期治疗中发挥重要作用，也为进一步阐明GOLPH3与胃癌发生的可能机制提供了实验基础。

参考文献：

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[3] Wang JH, Chen XT, Wen ZS, et al. High expression of golph3 in esophageal squamous cell carcinoma correlates with poor prognosis[J]. PLoS One,2012,7(10):e45622.

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Effect of silencing GOLPH3 on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells

XIEFang1,LAIMingyu,NONGYuncui,SUTing

(1TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of specifically silencing Golgi phosphoprotein 3 (GOLPH3 ) gene on proliferation and apoptosis of gastric cancer cells, and to investigate the mechanism.MethodsThe human gastric carcinoma cells SGC-7901 were randomly divided into 3 groups. Cells of group A were transfected with lentiviral-mediated siRNA sequences while cells of group B were transfected with lentiviral-mediated scramble sequences and group C without transfection. The cell proliferation was detected by methyl thiazol tetrazolium (MTT) at 72 h after transfection. The apoptotic rate was detected by flow cytometry. The protein expression of GOLPH3, mammalian target of rapamycin (mTOR) and p-mTOR was examined by Western blotting. ResultsThe OD value of group A was lower than those of groups B and C at different time points, the apoptotic rate of A group (2.70%±0.11%) was statistically higher than that of group B (0.42%±0.02%) and group C (0.31%±0.02%), and the relative expression of GOLPH3 and p-mTOR protein of group A was lower than that of groups B and C (all P<0.05); no significant differences in the above indexes were found between groups B and C (all P>0.05). ConclusionSilencing GOLPH3 can inhibit the cell proliferation and promote the apoptosis of gastric cancer cells and the mechanism may be related with the down-regulated expression of p-mTOR in SGC-7901 cells.

Key words:gastric carcinoma cells; Golgi phosphoprotein 3; small interfering RNA; cell proliferation; cell apoptosis; mammalian target of rapamycin

(收稿日期：2015-10-21)

中图分类号：R735.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)10-0007-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.10.003

通信作者简介：赖铭裕(1969-)，男，主任医师,主要研究方向为胃癌发病机制。E-mail: 2411423770@qq.com

作者简介：第一谢芳(1986-)，女，在读硕士研究生，主要研究方向为胃癌发病机制。E-mail: 993661989@qq.com

基金项目：广西医疗卫生适宜技术研究与开发资金资助项目(S201415-01)。