倪丽菊，赵丽亚，赵立虎，赵莹，高诚*

(1.上海实验动物研究中心， 上海　201203; 2.上海西普尔-必凯实验动物有限公司， 上海　201203;3.上海斯莱克实验动物有限责任公司， 上海　201615)



研究报告

利用多重荧光STR技术分析上海地区7品系常用近交系小鼠核心群的遗传特性

倪丽菊1，赵丽亚2，赵立虎3，赵莹2，高诚1*

(1.上海实验动物研究中心， 上海201203; 2.上海西普尔-必凯实验动物有限公司， 上海201203;3.上海斯莱克实验动物有限责任公司， 上海201615)

【摘要】目的 比较上海地区7品系常用近交系小鼠核心群的遗传特性。 方法 将筛选到的48对多态性丰富的微卫星引物组合优化，形成11组多重荧光PCR引物混合体系，对来自上海地区两大实验小鼠供应商的7品系近交系小鼠核心群的DNA样进行分型检测。利用遗传分析软件进行数据分析。结果来自两大供应商的7品系近交系小鼠在48个微卫星位点上都为纯合子。同一种群内小鼠的STR位点结果均一致；不同种群小鼠无论品系是否相同，相互间均存在STR位点差异。但相同品系不同种群近交系小鼠间的遗传距离与不同品系小鼠种群间的遗传距离相比均较近。在UPGMA聚类树中，相同品系的不同种群均首先两两聚成一类。C57BL/6小鼠与其他6品系小鼠的亲缘关系均较远。结论上海地区不同供应商的7品系近交系小鼠核心群间均存在STR位点差异。

【关键词】近交系小鼠；微卫星；多重PCR；遗传特性

近交系小鼠作为一种重要的实验动物因具有高度的遗传同一性，被广泛应用于现代生物医学研究中，其遗传质量直接影响到动物实验的准确性、重复性和科学性。定期对其进行遗传监测是保证其遗传质量的重要措施。利用微卫星标记对小鼠进行遗传检测近年来国内有较多报道[1-7]，但各位学者所选微卫星位点的位置和数量各不相同，检测方法也有所不同，尚处于摸索阶段。对微卫星的有效筛选和高效利用是微卫星检测技术的关键。本研究将高通量的多重荧光PCR方法应用到小鼠微卫星检测技术中，利用筛选到的48个微卫星标记对上海地区两大实验小鼠供应商的7品系常用近交系小鼠核心群进行比较分析，以了解目前上海地区近交系小鼠种质资源的遗传特性。

1材料与方法

1.1DNA样本

选择常用的7品系近交系小鼠，DBA/2Slac、BALB/cAnSlac、C3H/HeJSlac、C57BL/6JSlac、CBA/JSlac、FVB/NJSlac、129/S3Slac的DNA样由上海斯莱克实验动物有限责任公司【SCXK(沪)2012-0002】提供，DBA/2Bkl、BALB/cBkl、C3H/HeBkl、 C57BL/6Bkl、CBA/CaBkl、FVB/NJBkl、129/SvEvBrd/Bkl的DNA样由上海西普尔-必凯实验动物有限公司【SCXK(沪)2013-0016】提供。将各DNA样浓度稀释至25～50 ng/μL，-20℃冷冻保存备用。所用近交系小鼠均为核心群动物，SPF级。每单位每品系各选6～8只，雌雄各半。

1.2微卫星位点的选取

参考MMDBJ数据库 (Mouse Microsatellite Data Base of Japan)(http://www.shigen.nig.ac.jp/mouse/mmdbj/top.jsp)及文献[8，9]，选取在不同小鼠品系间多态信息丰富的位点，均匀分布于19条常染色体和X染色体，每条染色体选2～3位点。

1.3试剂

微卫星扩增试剂Type-itTMMicrosatellite PCR Kit购自Qiagen公司。各微卫星位点上游PCR引物的5’端用FAM或HEX荧光染料标记，所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成与标记，具体引物信息见表1。

1.4基因组STR的PCR分型

将筛选的48个STR位点根据产物大小、引物扩增效率和荧光标记的不同，组合成11组3-5重荧光PCR分型方案对两家单位的7品系小鼠DNA共计111份样品(必凯56份，斯莱克55份)进行分型。PCR反应体系为10 μL: 2× Type-it Multiplex PCR Master Mix 5 μL,多重引物混合液适量,5× Q-Solution 2 μL, 模板DNA 75 ng，RNase-free water补足10 μL。反应程序: 95℃ 热激活5 min，95℃变性30 s，60℃复性90 s，72℃延伸30 s，循环28次，最后60℃延伸30 min。

表1　48个小鼠微卫星位点的荧光标记引物信息

1.5PCR产物检测

将多重荧光PCR产物通过ABI3730测序仪的毛细管凝胶电泳进行扫描检测，ROX标记的标准分子量片段[10]为内参，用Gene Scan 3.1软件收集测序仪毛细管凝胶电泳的数据，用Gene Mapper软件分析各位点的片段大小。

1.6统计分析

根据Nei的公式计算各品系小鼠间的遗传距离。

其中:r：微卫星座位数目；mj：第j微卫星座位所具有的等位基因数目；xij、yij：分别为x群体、y群体第j微卫星座位第i等位基因的基因频率。最后，用MEGA软件中的非加权组平均法(unweighted pair group method with arithmetic means，UPMGA)进行聚类分析，构建聚类关系树。

2结果

2.1微卫星多重荧光PCR产物的毛细管凝胶电泳

将48个微卫星位点组合成11组多重荧光PCR分型方案对7品系111只近交系小鼠DNA样进行扩增，产物经毛细管凝胶电泳扫描检测。图1为1只C3H/HeBkl小鼠在D18Mit31、D16Mit38、D11Mit4、D5Mit20、D8Mit11等5个微卫星位点上的多重PCR产物的扫描结果。

2.248个微卫星位点的PCR分型结果

本实验选取的两家单位7品系近交系小鼠在48个微卫星位点的扩增结果(见表2)显示都为纯合子。不同品系的近交系小鼠在各位点上表现出良好的多态性，等位基因数为2-7个。同一单位的同品系小鼠在48个微卫星位点上的扩增结果均一致，在种群内表现为单态性。同品系小鼠在不同单位种群间存在差异，其中差异最大的是CBA/CaBkl和CBA/JSlac，两种群CBA小鼠在16个微卫星位点上存在差异；其次是C57BL/6Bkl和C57BL/6JSlac，两种群C57BL/6小鼠在10个位点上存在差异；差异最小的是FVB/NJBkl和FVB/NJSlac，两种群FVB小鼠只在1个微卫星位点上有差异。

表2　48个微卫星标记在各品系小鼠种群中的分型结果(bp)

图1　C3H/HeBkl小鼠的一个5重荧光PCR产物的电泳扫描结果Fig.1　The electrophoresis results of C3H/HeBkl mouse prouducts in a 5-plex fluorescent-PCR

2.3各种群近交系小鼠间的遗传距离分析

基于等位基因频率计算出来自两单位的7品系近交系小鼠共计14个种群间的Nei遗传距离，如表3所示。不同单位种群的同品系小鼠间的遗传距离均较近，最近的是FVB/NJBkl与FVB/NJSlac之间，遗传距离为0.0208；最远的是CBA/CaBkl和CBA/JSlac之间，遗传距离为0.3333。不同品系小鼠种群间的遗传距离均较远，最远的是C57BL/6JSlac与BALB/cBkl之间和C57BL/6JSlac与BALB/cAnSlac之间，遗传距离均为0.9583。

表3　14个近交系小鼠种群间的遗传距离及等位基因有差异的微卫星位点数目

2.4各种群近交系小鼠的聚类分析

根据Nei遗传距离，用UPGMA法构建的聚类树结果如图2所示，不同单位种群的同品系近交系小鼠均因亲缘关系最近，首先聚成一类。不同品系的近交系小鼠间，FVB与129首先聚在一起，再与BALB/c聚成一分支；C3H与CBA聚在一起后，再与DNA/2聚成一分支；两组分支聚在一起后，最后与C57BL/6聚类，由此可见，C57BL/6小鼠与其他6品系小鼠的亲缘关系均较远。

图2　基于Nei遗传距离构建的14个近交系小鼠种群的UPGMA聚类树Fig. 2　The UPGMA clustering tree based on Nei’s genetic distance for 14 populations of the inbred mice

3讨论

近年来，微卫星标记因具有分布广、数量多、多态性高、具共显性等优点，被作为一种重要、成熟的遗传工具广泛应用于各类实验动物的遗传检测研究中。

目前，微卫星DNA扩增产物的电泳分型方法有琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳、毛细管凝胶电泳等。琼脂糖电泳操作相对简单，但由于STR扩增产物多数集中在100～200 bp 之间而且某些等位基因大小比较接近，随着电泳时间的增加，一些小片段扩增产物的条带易模糊，琼脂糖凝胶的分辨率低，不能准确区分不同大小的等位基因。聚丙烯酰胺电泳是应用较多的微卫星产物分型检测方法，分辨率高，可以分辨出长度差为l～2 bp的DNA片段，但制胶和染色操作步骤繁琐，耗时、耗力、非自动化，在大规模多批次的数据收集和分析时存在相当大的难度，而且经常会有影子带的产生干扰结果的判断。DNA全自动测序仪的毛细管凝胶电泳技术是近年来快速发展和具有广泛应用前景的新技术，该技术将荧光标记的PCR产物和标准分子量样品(内参)在同一毛细管中进行电泳，DNA分析仪将结果自动记录在计算机上，利用片段分析软件进行图像收集和分析，精确计算出微卫星等位基因片段的大小。毛细管凝胶电泳检测PCR产物具有微量、高度自动化、结果更加准确等明显优势，是今后微卫星检测的发展方向。本研究将多重荧光PCR检测方法和毛细管凝胶电泳应用了到微卫星的分型检测中，将筛选到的48个微卫星位点组合成11组多重PCR分型方案。该方案是在同一个PCR反应体系中对同一样本采用3-5种引物同时进行扩增检测，将实验成本降低至近四分之一，同时减少了操作时间，提高了实验效率。微卫星的多重荧光PCR检测技术可以有效降低成本、提高通量，使小鼠微卫星遗传检测更为简单、经济、高效和准确，可满足规模化检测的需要。

本研究建立的微卫星多重荧光PCR分型方案含48个微卫星位点，覆盖了小鼠1-19号常染色体和X染色体，能够较全面地从分子水平反映各品系独特的遗传概貌，可用于常用近交系小鼠种群的遗传特性分析、日常遗传质量监测、品系鉴定等。如用于品系鉴定，一组含5个微卫星位点的多重PCR 反应(如图1)即可将这7品系区分开。

对上海地区两大实验小鼠供应商的7品系近交系小鼠核心群的微卫星分析发现，两家单位各自的7品系小鼠种群在48个微卫星位点上的基因纯合度都为100%，说明这些品系的核心群动物保持着良好的遗传稳定性。比较两家单位的7品系近交系小鼠共计14个核心群在48个微卫星位点上的扩增结果发现，各种群之间都有部分位点的结果存在差异，具有差异的位点数在2-46个之间。同品系近交系小鼠的不同单位种群间有差异的位点数均较少、遗传距离均较近，其中差异最大的是CBA/CaBkl和CBA/JSlac，其次是C57BL/6Bkl和C57BL/6JSlac，这与本课题组其他研究人员用51个SNP位点分析相同DNA样本的结果(另文发表)一致。作者认为，同品系不同单位种群近交系小鼠间STR位点存在差异的原因，一是由亚系不同导致，如CBA/CaBkl和CBA/JSlac；二是由两家单位同一品系小鼠的引种单位不同引起，两个引种单位的小鼠在长期的培育过程中出现了遗传分化。不同品系的近交系小鼠种群在这48个位点上有着丰富的多态性，等位基因数为2-7个，以含3-4个等位基因的位点居多，达三分之二以上。不同品系的近交系小鼠中， C57BL/6JSlac与BALB/cBkl、BALB/cSlac间差异最大，均有46个位点存在差异，遗传距离亦最远，表明C57BL/6小鼠与BALB/c小鼠间的亲缘关系最远，这与韩喜彬等[1]用10个微卫星位点对辽宁省BALB/c、C57BL/6、C57BL/10、DBA/2、FVB/N、129等6品系常用近交系小鼠进行遗传质量分析时发现的结果一致。C3H/HeBkl与CBA/CaBkl、CBA/JSlac间差异最小，遗传距离最近。

研究表明，上海地区两大供应商的DBA/2、BALB/c、C3H/He、C57BL/6、CBA、FVB/NJ、129等7品系小鼠核心群的遗传特性是有差异的，本研究为相关小鼠品系积累了遗传背景资料，建立的多重荧光STR技术可以从DNA水平对实验小鼠进行快速高通量的遗传监测。

(致谢: 感谢上海斯莱克实验动物有限责任公司、上海西普尔-必凯实验动物有限公司为本研究提供近交系小鼠DNA样品。)

参考文献

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Genetic characteristics of seven inbred mouse strains in core colonies from Shanghai analyzed using fluorescent multiplex STR

NI Li-ju1, ZHAO Li-ya2, ZHAO Li-hu3, ZHAO Ying2, GAO Cheng1*

(1. Shanghai Laboratory Animal Research Center，Shanghai 201203, China; 2. Sino-British SIPPR/BK Laboratory Animal Ltd. Co., Shanghai 201203; 3. Shanghai SLAC Laboratory Animal Ltd. Co., Shanghai 201615)

【Abstract】ObjectiveTo analyze the genetic characteristics of seven frequently-used inbred mouse strains in core colonies from Shanghai suppliers. Methods 48 pairs of microsatellite primers with high polymorphism were screened out and combined into 11 sets of multiplex PCR primer mix labelled with two dyes (FAM and HEX). By these primer mix, the DNA samples of the seven strains were genotyped. The genotyping data were analyzed using statistical software. Results All the 48 microsatellite loci were homozygous for all inbred mice of the seven strains. On each microsatellite locus, the PCR results of the mice in the same population showed monomorphism, and that of the mice in different populations showed polymorphism, whether the populations were of the same strain or not. But the genetic distances between the populations of the same strain were all closer than that of different strains. The phylogenic tree showed that the populations of the same strain were first get into one cluster. The genetic relationship between the strains of C57BL/6 and other six strains were all far. Conclusions Genetic differences exist on 48 microsatellite loci between the core colonies of seven inbred mouse strains from two suppliers in Shanghai.

【Key words】Inbred mice; Microsatellite; Multiplex PCR; Genetic characteristics

[收稿日期]2015-07-24

Corresponding author:GAO Cheng, E-mail: gaochengdgb@126.com

Doi:10.3969/j.issn.1005-4847.2016.01.013

【中图分类号】Q95-33

【文献标识码】A

【文章编号】1005-4847(2016) 01-0072-08

[作者简介]倪丽菊，副研究员，研究方向：实验动物遗传学。E-mail: niliju@163.com[通讯作者]高诚，研究员，E-mail: gaochengdgb@126.com

[基金项目]上海市科委基金项目(No.12140900402)。