张　萍，王　雄，孙姣卓

山西医科大学第一医院(太原 030001)



特布他林对大鼠心肌缺血再灌注损伤的作用研究

张萍，王雄，孙姣卓

山西医科大学第一医院(太原 030001)

摘要：目的分析特布他林能否减轻心肌缺血再灌注损伤，并探讨其机制。方法 32只雄性SD大鼠随机平分为假手术(sham)组、缺血再灌注(I/R)组、特布他林(terbutaline)组、特布他林加内皮型一氧化氮合酶(eNos)抑制剂(terbutaline+L-NAME)组，建立心肌缺血再灌注模型，并根据实验需要给予不同处理。用苏木素伊红(HE)染色后在光镜下观察各组大鼠心肌组织形态学改变；免疫组化法测各组大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax、eNOS蛋白的灰度值，间接反映蛋白表达量；黄嘌呤氧化酶法测各组大鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)活力、硫代巴比妥法测各组大鼠血清中丙二醛(MDA)的浓度。结果与I/R组相比，terbutaline组大鼠心肌细胞损伤程度较轻，Bcl-2及eNOS蛋白的表达、血清中SOD活力增加，而Bax的表达、血清中MDA的含量减少，差异均有统计学意义(P<0．05)。结论特布他林能通过抗凋亡、抗氧化应激来保护心肌组织，减轻心肌缺血再灌注损伤。

关键词：缺血再灌注损伤；特布他林；内皮型一氧化氮合酶；凋亡；超氧化物歧化酶；丙二醛；大鼠

随着人口老龄化、肥胖、高血压、糖尿病等危险因素的增加，急性心肌梗死的发病率也在增高。2011年联合国高峰会议提出，到2025年使因心血管病等的致死率降低25%(25×25目标)[1]。心肌细胞对缺血缺氧十分敏感，及时开通冠脉恢复血流可降低致死率并改善预后，但是开通冠脉后直接面临的问题是心肌缺血再灌注损伤(MIRI)。目前因临床缺乏理想有效的MIRI治疗药物，而引起世界各国学者的广泛关注和研究。β受体是交感神经系统的一个环节，也是G蛋白偶联受体超家族的一员，在心血管系统的信号传导过程中起重要作用。近年来陆续有研究发现β2受体激动剂能抑制心肌细胞凋亡、改善心功能、抑制心肌肥厚与心肌重塑，用于治疗心力衰竭[2-4]，但是涉及MIRI的不多。本研究就呼吸科常用药物特布他林对MIRI是否有保护作用及其机制展开研究，旨在为MIRI治疗药物的进一步研究开发提供参考和思路。

1材料与方法

1．1主要试剂及仪器硫酸特布他林注射液(成都华宇制药有限公司馈赠，规格1 mL∶0．25 mg/支，6支/盒)；左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)，购自上海金穗生物科技有限公司，每支1 g；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；Bcl-2、Bax、eNOS免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；HX-300动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)，RM6240B型生理实验系统成都仪器厂；美国aperio公司Scanscope数字病理扫描系统等。

1．2缺血再灌注模型制备SD大鼠称重后，用20%乌拉坦(4 mL/kg)腹腔注射麻醉后仰卧固定，连续监测Ⅱ导联心电图。气管插管，连动物呼吸机行机械通气(潮气量7 mL，呼吸频率70次/min，吸呼比为1∶2)。于大鼠心尖搏动明显处逐层分离暴露心脏，轻轻打开心包，于左心耳根部下方穿线绕过冠状动脉左前降支(LAD)，用套管夹闭法来阻断冠脉血流30 min造成缺血，松开止血钳再灌注2 h。模型成功标准：夹闭后LAD供血区域颜色变暗、心电图Ⅱ导联ST段抬高≥0．1 mV，松开后ST回落大于50%。

1．3动物分组及实验设计体重200 g～250 g，32只雄性SD大鼠(中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供)，用随机数字表法随机平分为4组：假手术(sham)组、缺血再灌注(I/R)组、特布他林(terbutaline)组、特布他林加内皮型一氧化氮合酶抑制剂(terbutaline+L-NAME)组。Sham组 LAD下只穿线，不夹闭；I/R组：单纯经历可逆性夹闭LAD致心肌缺血30 min，随后再灌注2 h；terbutaline组：缺血前5 min经股静脉注射特布他林注射液1 mg/kg；terbutaline+L-NAME组：缺血前5 min经股静脉注射特布他林注射液1 mg/kg，再灌注前10 min经股静脉注射L-NAME 10 mg/kg。再灌注2 h结束时，开腹经腹主动脉抽取动脉血约4 mL，静置后离心(3 000 r/min)10 min，留取上层血清，用于检测SOD活力和MDA含量。处死大鼠，取出心脏，冲洗后放于10%的甲醛中固定，供心肌组织形态学观察和免疫组化用。血清与心肌组织标本置于-20℃冰箱中保存，统一送检。

1．4心肌组织形态学观察从冰箱取出甲醛浸泡的32个心肌组织，分别切取梗死交界区心肌组织，经石蜡包埋、切片、HE染色后，在光镜下(×100)观察各组大鼠心肌组织形态学有无变化。

1．5免疫组化方法检测心肌中Bax、Bcl-2、eNOS蛋白的表达包埋好的蜡块经切片后，严格按试剂说明书滴加一抗、二抗，经链霉亲和素-生物素复合物(SABC)方法染色、二氨基联苯胺(DAB)显色等步骤后用中性树脂封片。用PBS代替一抗作为阴性对照。三种蛋白阳性表达的细胞胞浆内有棕黄色颗粒。利用数字病理扫描及图像分析系统，每个切片任选5个阳性视野，测其平均灰度值(灰度值越高，蛋白表达水平越低)。

1．6血清SOD活力、MDA含量的检测将32个血清标本从冰箱取出，严格按相应指标说明书执行操作步骤，黄嘌呤氧化酶法测各组大鼠血清中超氧化物歧化酶活力、硫代巴比妥法测各组大鼠血清中丙二醛的浓度，用分光光度计测出OD值，再根据相应公式计算各组大鼠血清中SOD活力和MDA含量。

2结果

2．1各组大鼠心肌组织(梗死交界区)形态学观察结果(见图1)Sham组大鼠心肌肌纤维排列整齐，结构清晰，细胞偶有水肿；I/R组大鼠心肌肌纤维排列紊乱，结构不清，细胞高度水肿；terbutaline组大鼠心肌肌纤维排列尚整齐，结构较清晰，细胞少量水肿；terbutaline+L-NAME组心肌纤维排列乱，细胞有水肿。心肌损伤程度sham组最轻，terbutaline组次之，I/R组与terbutaline+L-NAME组较重。

图1　4组大鼠心肌组织(梗死交界区)形态

图2　4组大鼠Bcl-2蛋白(×400)学变化的HE染色结果(×100)

图3　4组大鼠Bax蛋白免疫组化结果(×400)

图4　4组大鼠eNOS蛋白免疫组化结果(×400)

2．2免疫组化方法测Bcl-2、Bax、eNOS蛋白表达水平灰度值越大，蛋白表达水平越低。详见表1、图2～4。Bcl-2表达水平：与sham组比，I/R组的Bcl-2表达水平升高，terbutaline组的表达水平更高，terbutaline+L-NAME组比terbutaline组表达水平低，任意两组之间的差异均有统计学意义(P<0．05)。详见表1。

Bax表达水平：与sham组比，I/R组的Bax表达水平升高，terbutaline组的表达水平较I/R组低，terbutaline+L-NAME组较terbutaline组表达水平高，任意两组之间的差异均有统计学意义(P<0．05)。

eNOS蛋白表达水平：与sham组比，I/R组的eNOS表达水平较低，terbutaline组的表达水平较I/R组高，terbutaline+L-NAME组较terbutaline组表达水平低，任意两组之间的差异均有统计学意义(P<0．05)。

表1　4组大鼠心肌免疫组化灰度值(±s)

2．3大鼠血清SOD活力、MDA含量的检测结果(见表2)与sham组比较，其余3组的SOD活力均降低，terbutaline组降低幅度最小，任意两组之间差异有统计学意义(P<0．05)。与sham组比较，其余3组的MDA含量均增加，terbutaline组增加幅度最小，任意两组之间差异有统计学意义(P<0．05)。

表2　4组大鼠血清中SOD活性与MDA含量(±s)

3讨论

减轻心肌缺血再灌注损伤除了可采用溶栓、急诊介入等手段尽早开通冠脉恢复血流，采用低压、低温、低钙灌流液以外，还可使用药物减少心肌凋亡、清除活性氧、启动细胞内源性保护机制、补充能量等措施。心肌细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的重要过程，减少细胞凋亡可有效减轻心肌缺血再灌注损伤。本研究发现，与I/R组相比，加用特布他林后心肌细胞损伤程度减轻；抗凋亡的Bcl-2蛋白表达增多，而促凋亡的Bax蛋白表达减少，提示特布他林有抗凋亡、保护心肌细胞的作用。NO已被公认有心血管保护作用，可扩张血管、降低血压、松弛平滑肌，有酶活性调节、免疫调节、抗氧化损伤等作用。Shashi Bhushan等[5]证实长效β2受体激动剂福莫特罗的心肌保护作用是通过活化eNOS，并增加体内NO的生物利用度来实现的，将β2受体-Gi蛋白-磷脂酰肌醇激酶-3-蛋白激酶B(β2AR-Gi-PI3K-Akt)信号通路扩展为β2AR-Gi-PI3K-Akt-eNOS-NO。本研究中，与I/R组相比，terbutaline组eNOS表达增多，提示特布他林也能改善血管内皮功能，促进NO的合成。

氧自由基的生成是MIRI的重要机制之一，SOD是体内主要的抗氧化酶，可清除氧自由基，其活力可反映机体抗氧化防御水平；MDA是脂质过氧化反应的产物，其含量可反映组织损伤的严重程度[6]。本研究中，与I/R组相比，terbutaline组血清中SOD活力增加，MDA含量减少。提示特布他林减轻MIRI的作用与其能抗氧化应激有关。

特布他林是短效β2受体激动剂，可舒张气道平滑肌、增加气道纤毛摆动等，用于缓解哮喘、肺气肿等引起的呼吸困难。如能证实特布他林可减轻MIRI，则可拓宽特布他林的适应证，也能为缺血再灌注病人提供一个“新”的治疗药物。鉴于特布他林对缺血心肌有保护作用，这可能为减轻MIRI提供新的治疗思路：特布他林可使冠心病合并呼吸系统疾病的病人双重获益；不伴有呼吸系统疾病的冠心病病人，特布他林可以联合美托洛尔用于冠心病的治疗。

本研究中的大鼠健康状况良好，模型为缺血30 min、再灌注2 h，但对于伴随多个危险因素或病情复杂的病人会出现怎样的预后尚未可知，以及是否存在剂量效应关系、时间效应关系等都有待于进一步研究。

参考文献：

[1]胡大一．控制6个危险因素实现25×25目标[J]．中华心血管病杂志，2015，43(5)： 377-377．

[2]Andrew J，Patterson MD，Zhu Weizhong，et al ．Protecting the myocardium： a role for the β2adrenergic receptor in the heart[J]．Crit Care Med，2004，32：1041-1048．

[3]Ahmet I，Krawczyk M，Heller P，et al．Beneficial effects of chronic pharmacological manipulation of β-adrenoreceptor subtype signaling in rodent dilated ischemic cardiomyopathy[J]．Circulation，2004，110：1083-1090．

[4]Zhao Mingming ，Giovanni Fajardo，Takashi Urashima．Cardiac pressure overload hypertrophy is differentially regulated by β-adrenergic receptor subtypes[J]．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，301： H1461-H1470．

[5]Shashi Bhushan，Kazuhisa Kondo，Benjamin L，et al．Selective β2-adrenoreceptor stimulation attenuates myocardial cell death and preserves cardiac function after ischemia-reperfusion injury[J]．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32(8)： 1865-1874．

[6]程向娟，王雄，滕晓焕．利拉鲁肽可对抗大鼠心肌缺血再灌注损伤[J]．中华心血管病杂志，2015，43(3)：259-263．

(本文编辑王雅洁)

Effect of Terbutaline on Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Rats

Zhang Ping，Wang Xiong，Sun Jiaozhuo

First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China Corresponding Author： Wang Xiong

Abstract：ObjectiveTo explore the effect and its mechanism of terbutaline on myocardial ischemia-reperfusion(I/R) injury.MethodsThirty-two male Sprague-Dawley(SD) rats were divided into four groups randomly and equally，sham group，I/R group，terbutaline group，terbutaline+L-NAME group．I/R injury model was established.The different disposal methods were given according to the experiment．Myocardial morphology was observed under light microscope by Hematoxylin-Eosin (HE) staining method.The protein expression of Bcl-2，Bax，endothelial nitric oxide synthase (eNOS) was analyzed by immunohistochemical technique．The xanthine oxidase method was used to detect superoxide dismutase (SOD) activity．The concentration of malondialdehyde(MDA) was measured by thiobarbituric acid method．ResultsCompared with the I/R group，the degree of myocardial damage in terbutaline group was significantly reduced．The expression of Bcl-2 and eNOS protein and SOD activity was significantly increased，while the expression of Bax and concentration of MDA was evidently reduced．Conclusion Terbutaline can protect myocardial tissues and attenuate myocardial I/R injury due to its anti-apoptosis，improving endothelial function，and antioxidation.

Key words：ischemia-reperfusion injury；terbutaline；endothelial nitric oxide synthase；apoptosis；rats

(收稿日期：2015-11-13)

中图分类号：R542R285

文献标识码：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．05．013

文章编号：1672-1349(2016)05-0491-04

通讯作者：王雄，E-mail： sxwangxiong@163．com