张旺德， 赵孝梅， 刁晓艳， 何　燕*， 官志忠

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳　550004； 2.贵州医科大学附院 心血管内科， 贵州 贵阳　550004)



内皮型一氧化氮合成酶基因rs3918181位点多态性与贵州汉族原发性高血压的关系*

张旺德1**， 赵孝梅1， 刁晓艳2， 何燕1***， 官志忠1

(1.贵州医科大学 分子生物学重点实验室， 贵州 贵阳550004； 2.贵州医科大学附院 心血管内科， 贵州 贵阳550004)

[摘要]目的： 探讨贵州省汉族人群内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)基因第14内含子rs3918181位点多态性与原发性高血压(EH)的关系。方法： 选取贵州汉族人群的原发性高血压患者169例和健康对照者164例，应用TaqMan探针法对eNOS基因rs3918181位点进行基因分型，分析不同基因型与EH发病关系。结果： EH组患者的AA、AG和GG基因型频率分别为0.095、0.426和0.479，对照组分别为0.104、0.408和0.488，两组间差异无统计学意义(P>0.05)；EH组A与G等位基因频率分别为0.308和0.692，对照组分别为0.308和0.692，两组间差异无统计学意义(P>0.05)。结论： eNOS基因rs3918181位点多态性与贵州省汉族原发性高血压可能无关。

[关键词]高血压； 一氧化氮合酶； 基因多态性； 等位基因； 基因型； 汉族； 贵州

原发性高血压(essential hypertension, EH)是多基因遗传病，受遗传和环境因素的共同作用，但遗传因素起着重要作用，因此从基因水平探讨EH的发病机制是重要的研究方向[1]。近年来国内外研究发现，内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因多态性与高血压有密切关系，被认为是高血压的重要候选基因[2]。本研究旨在探讨eNOS基因rs3918181位点多态性与贵州省汉族人群EH的关系。

1对象与方法

1.1研究对象

选择2014年3月～2015年3月在心内科门诊及住院部就诊的高血压患者169例为EH组，按2010年中国高血压防治指南的标准诊断；排除继发性高血压、心肌病、瓣膜疾病、先天性心脏病及肝、肾衰竭，孕妇、哺乳期妇女以及精神疾病史或滥用药物者，EH组男性75例，女性94例，平均(58.08±11.29)岁。另选健康体检者共164例，其中男75例，女89例，平均年龄(55.84±10.51)岁，无高血压家族史，无各类心血管、脑血管、肾、内分泌等方面疾病。两组研究对象在性别、年龄构成上差异无统计学意义。两组均为贵州籍汉族人，相互间均无血缘关系。

1.2方法

1.2.1血压测定采用校正的水银柱式血压计(刻度以2 mmHg为单位)于上午10∶00～12∶00测定血压；测血压前30 min 内禁止吸烟和饮咖啡，避免劳累、紧张和兴奋，静坐5 min，裸露右侧上臂，肱动脉置于和心脏同一水平线位置，每次重复测量3 次，测量相隔5 min/次，取3 次测量的平均值，由专人使用相同血压计测量。

1.2.2基因组DNA的提取实验前夜禁食12 h以上，次晨抽取空腹肘静脉血液标本5 mL，用EDTA抗凝管；按经典常规法(酚-氯仿法)抽提白细胞DNA，溶于TE；紫外吸收法定量后标化模板为30 g/L，-40 ℃备用。

1.2.3基因分型应用TaqMan 实时荧光定量PCR技术对eNOS基因rs3918181位点进行基因分型。PCR反应体系为10 μL：模板DNA 1.5 μL，通用TaqMan PCR Master Mix 5 μL，20×Assay Working Stock 0.25 μL，加ddH2O补足10 μL。TaqMan PCR Master Mix、20×Assay Working Stock均购自美国ABI公司，内含的两个探针分别用VIC、FAM染料标记。反应条件为：60 ℃ 30 s，95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60℃ 1 min 20 s，共55个循环，60 ℃ 30 s，仪器采用美国AB公司生产的Step One Plus 实时荧光定量PCR系统，读取VIC/FAM荧光判断基因分析结果。VIC荧光探针识别A等位基因，FAM荧光探针识别G等位基因。每块96孔板设3孔阴性对照，并随机抽取5%样本复测，一致性为100%。

1.3统计学处理

统计分析采用SPSS 19.0软件。研究对象的Hardy-weinberg平衡符合程度、组间基因型、等位基因频率比较采用χ2检验。两组计量资料组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1基因型分布的Hardy-Weinberg遗传平衡检测

实验结果显示，EH组和对照组人群eNOS基因rs3918181位点均存在A和G等位基因，有AA纯、AG杂合、GG纯3种基因型，见图1。两组的基因型频率经χ2检验，符合Hardy-Weinberg遗传平衡(P>0.05)，见表1。

注：红点、绿点、蓝点分别为rs3918181位点AA野生纯合型、AG杂合型、GG纯合突变型，黑色方块代表空白对照(NTC)图1　人基因组rs3918181 (eNOS) 位点TaqMan探针实时荧光定量PCR分型Fig.1　The genotyping results of rs3918181 (eNOS) SNP loci by using TaqMan probe real-time quantitative PCR

2.2基因型和等位基因频率分布

经χ2检验两组基因型频率分布差异无统计学意义(χ2=0.141，P>0.05)，两组等位基因频率分布差异无统计学意义(χ2=0.000，P>0.05)，见表1。

表1　两组被检者eNOS基因rs3918181位点的基因型和等位基因频率分布

3讨论

eNOS基因在人类染色体上位于7q35-q36，全长约21 kb，包含26个外显子和25个内含子，其编码的mRNA可翻译生成1 203个氨基酸[3]。eNOS的作用是催化血管内皮左旋精氨酸和氧分子经多步氧化还原反应生成一氧化氮(NO)，内皮来源的NO是调节血压和维持正常血流的重要分子[4]；研究表明人体内源性NO的持续生成主要由eNOS调节，因此eNOS基因序列的多态性通过影响eNOS的功能而影响人体内NO的浓度[5]。Bonnardeaux[6]等研究显示，eNOS的表达异常或eNOS的活性降低，NO的合成就会减少，引起机体的外周血管阻力增加，血压就会升高。故eNOS基因已成为高血压病的候选基因之一。

目前国内外关于eNOS基因多态性与EH关系研究多集中于第7外显子894位点[7-9]、启动子区786位点[10-12]以及第4内含子[13-15]，对第14内含子的研究相对较少，但所得结论都仍有争议。许多位于基因功能未知的区域或非编码区的遗传标记与疾病相关，内含子是基因组中重要的调控元件,可以直接对基因的表达起调控作用，也可通过自身的剪接影响基因的表达。高鹏等[16]对eNOS基因14内含子rs3918181位点多态性与脑卒中合并高血压关系的研究结果表明，eNOS基因rs3918181位点多态性可能与高血压的发生有关。闫雪等[17]对天津汉族290例EH患者和161名健康对照者的eNOS基因rs3918181位点多态性与EH的关系的研究结果显示，EH组患者AA、AG和GG基因型分布频率分别为0.293、0.393和0.314，A与G等位基因频率分别为0.490和0.510，与对照组相比基因型分布频率及等位基因频率差异有统计学意义，eNOS基因rs3918181位点多态性与EH相关。而关于eNOS基因rs3918181位点多态性与贵州地区汉族人群EH的关系研究至今尚未见报道。因此，本研究选取第14内含子rs3918181位点对贵州汉族人群的EH患者169例和健康对照者164例进行研究分析，结果显示EH组患者的AA、AG和GG基因型分布频率分别为0.095、0.426和0.479，A与G等位基因频率分别为0.308和0.692，与对照组相比基因型分布频率及等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)，表明eNOS基因rs3918181位点多态性与贵州汉族EH可能不相关。这与高鹏等[16]和闫雪等[17]的研究结果相反。而与杨波等[18-19]研究结果一致。以上研究结果间存在差异的可能原因：(1)研究方法及样本来源不同；(2)研究对象的遗传背景及基因多态性位点的作用强度不同；(3)生活习惯及居住环境不同。

总之，本研究结果提示eNOS基因rs3918181位点多态性与贵州汉族人群中EH可能无关，但本研究的样本量较小，容易产生统计偏差，仍需要进一步扩大样本量加以证实。

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(2015-10-08收稿，2015-11-30修回)

中文编辑： 周凌； 英文编辑： 刘华

Relationship between Rs3918181 Polymorphism of Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene and Essential Hypertension of Han Population in Guizhou

ZHANG Wangde1， ZHAO Xiaomei1， DIAO Xiaoyan2， HE Yan1， GUAN Zhizhong1

(1.KeyLaboratoryofMolecularBiology，GuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，Guizhou，China；2.InternalMedicine-

CardiovascularDepartment，AffiliatedHospitalofGuizhouMedicalUniversity，Guiyang550004，Guizhou，China)

[Abstract]Objective: To investigate the relationship between intron 14 th rs3918181 locus polymorphism of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) gene and essential hypertension (EH) in Han population of Guizhou Province. Methods: TaqMan probe method was adopted to analyse the rs3918181 polymorphism genotype of eNOS gene in 169 cases with EH and 164 cases of normal control group. Then the relationship between different genotypes and EH were explored. Results: The frequencies of AA, AG and GG genotypes were 0.095, 0.426 and 0.479 in EH group respectively, while the frequencies of AA, AG and GG genotypes were 0.104, 0.408 and 0.488 in control group respectively. There was no significant difference in frequencies of genotype distribution between two groups (P>0.05). The frequencies of A and G alleles were 0.308, 0.692 in EH group, and 0.308, 0.692 in control group. There was no significant difference in frequencies of allele distribution between two groups (P>0.05). Conclusions: The genetic polymorphism of rs3918181 locus in eNOS gene may not be associated with EH susceptibility in Han population of Guizhou Province.

[Key words]hypertension; nitric oxide synthase; genetic polymorphism; alleles; genotype; han population; Guizhou

[中图分类号]R342; R544.11

[文献标识码]A

[文章编号]1000-2707(2016)01-0008-04

*[基金项目]国家科技支撑计划项目(2013BAI05B03)； 贵州省“2011协同创新中心”[黔教合协同创新中心(2014)06号]

**贵州医科大学研究生学院2014级硕士研究生

***通信作者 E-mail:annieheyan@gmc.edu.cn网络出版时间：2016-01-07

网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160107.1825.008.html