杨鹏飞，李　娟*，张建中，李　翔

(1.宁夏医科大学总医院核医学科，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学基础医学院)



甲状腺结节患者血清Midkine检测及其临床意义

杨鹏飞1，李娟1*，张建中2，李翔1

(1.宁夏医科大学总医院核医学科，宁夏 银川 750004；2.宁夏医科大学基础医学院)

摘要：目的 分析中期生长因子(MK)在甲状腺良性和恶性结节患者血清中的水平，探讨MK对诊断甲状腺结节良恶性的临床意义。方法 收集因“甲状腺结节”入院行切除术171例患者的血清，收集健康体检各项指标均正常的22例正常人血清，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MK的浓度。结果 良性结节患者122例，MK的浓度为(1.54±0.57)ng/ml，恶性结节患者49例，MK的浓度为(3.46±1.44)ng/ml，正常对照组MK的浓度为(1.44±0.45)ng/ml。甲状腺恶性结节组血清中MK浓度明显高于良性结节组，两组间有显著性差异(P<0.05)，而甲状腺良性结节组与正常对照组的血清MK浓度接近，组间差异无统计学意义(P>0.05)；采用ROC曲线分析，以2.25ng/ml为阈值，对诊断甲状腺恶性结节有较高的诊断效能。结论 甲状腺恶性结节患者血清中MK浓度明显高于良性结节患者和正常人群，血清MK对甲状腺良恶性结节的诊断具有一定的临床意义。

关键词：甲状腺结节；Midkine；病理；ELISA

甲状腺结节是临床上常见的一种甲状腺病变，可分为良性和恶性结节。良、恶性甲状腺结节的临床表现相似，而治疗方式截然不同，良性结节多采取保守治疗，恶性结节则以手术为主的综合治疗；而据有关文献显示[1~3]，手术治疗后发现仅有5%~10%为恶性结节，因而术前对甲状腺结节性质的鉴别诊断有着非常重要的临床意义。中期生长因子(Midkine，MK)是一种肝素结合生长因子，多项研究[4~7]认为，MK在正常人的血清和组织中含量少，而在多种恶性肿瘤患者的血清和组织中含量高；也有研究[8]显示，血清MK的含量与分化型甲状腺癌患者的预后也有关系，认为MK有望作为一种肿瘤标志物。因此本研究通过对甲状腺结节患者和正常人血清MK的检测，旨在探讨MK对甲状腺良恶性结节的临床诊断价值，为临床诊断提供更好的参考意义和理论基础。

1资料与方法

1.1临床资料收集2014年8月至2015年7月因“甲状腺结节”在我院肿瘤医院就诊行甲状腺手术切除的171例患者的血清，其中男37例，女134例；年龄17~73岁，平均(48.8±12.1)岁，中位年龄49岁；所有患者术后有病理组织学检查结果。正常对照组22例，均为在我院体检且体检各项指标显示没有任何疾病的健康人群，平均年龄(41.23±6.7)岁。

1.2标本收集和保存所有研究对象的血清均为空腹后12h的晨间采集，手术切除患者的血清均为术前血清。收集到的血室温放置10~15min后于低温离心机3000×g离心20min，取上清放入试管中，存放于-80℃专用超低温保存箱(-80℃最长可保存6个月)。检测时提前取出放置2℃~8℃液化，30min后再放置室温，并用低温离心机1000×g离心15min后方可使用。

1.3仪器与方法

1.3.1仪器与试剂①酶标仪：美国伯乐公司(BIO-RAD)生产的Model 680型酶标仪，波长400~750nm。②试剂：MK试剂盒由武汉伊莱瑞特生物科技有限公司提供，货号为E-EL-H2297c，试剂批号为AK0015AUG04001(96管×2套，48管×1套)。

1.3.2MK的检测本实验采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法。按说明书配制8个浓度的标准品，分别在空白孔、标准孔和待测样品孔中加入样品稀释液、标准品和待测样品(实验前已做预实验，待测样品无需稀释)各100μl，加盖覆膜37℃孵育90min；弃去液体，甩干后每孔加入生物素化抗体工作液100μl(使用前15min内配制)，加盖覆膜后37℃孵育60min；弃去孔内液体，甩干，洗板3次(每孔大约350μl，每次浸泡1~2min)，甩干并在吸水纸上轻拍，将孔内液体拍干；每孔加入酶结合物工作液100μl，加上覆膜于37℃温育30min；弃去孔内液体，甩干，洗板5次；每孔加底物溶液(TMB)90μl，酶标板加上覆膜于37℃避光孵育15min左右(根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30min)；当标准孔出现明显梯度时，每孔加入终止液50μl，终止反应，此时酶标板孔内颜色由蓝色转为黄色，立即用酶标仪在450nm波长条件下测量各孔的光密度(OD值)。

1.3.3结果处理本实验中标准品都设有复孔，首先计算每个标准品的OD平均值和空白孔的OD平均值，用每个标准品OD平均值减去空白孔OD平均值，然后以标准品的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线；使用curve expert 1.4得出标准曲线的拟合方程式，将样品的OD值带入该方程式即可计算出样品浓度。

1.4统计学分析采用IBM SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，组间差异采用t检验，计数资料以率和百分比表示，采用配对四格表的χ2检验或校正的χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。以灵敏度为纵坐标，1-特异度为横坐标绘制真阳性率与假阴性率曲线，即ROC曲线，分析血清MK浓度诊断甲状腺恶性结节的最佳阈值和诊断效能。

2结果

经术后病理证实，171例甲状腺结节患者中，良性结节122例，恶性结节49例。良性结节组MK的浓度为(1.54±0.57)ng/ml，恶性结节组MK的浓度为(3.46±1.44)ng/ml，正常对照组MK的浓度为(1.44±0.45)ng/ml；恶性结节组MK浓度明显高于良性结节组，差异具有统计学意义(P=0.000，P<0.05)，而良性结节组MK浓度与正常对照组MK浓度接近，组间差异无统计学意义(P=0.659，P>0.05)。

根据病理结果，分别将良性结节组MK均值分别加1个、1.5个标准差，恶性结节组MK均值分别减1个和1.5个标准差，分析不同MK阈值诊断甲状腺恶性结节的敏感度、特异性和准确性。不同MK阈值判定甲状腺结节良恶性的情况见表1、表2。结果显示以良性结节组的MK均值加1.5个标准差即MK=2.395ng/ml为阳性结果判断阈值后，其特异度和准确度均较高，其值分别为91.80%和84.80%，阳性预测值为76.74%，阴性预测值为87.5%。

表1　MK不同浓度阈值判定甲状腺结节良恶性的情况(例)

表2　MK不同浓度阈值对甲状腺结节良恶性诊断的效能(%)

应用ROC曲线分析MK的浓度(图1)，得出MK对甲状腺结节良恶性的最佳诊断阈值为2.25ng/ml，其曲线下的面积为0.958(>0.90，P=0.000，P<0.01，诊断的真实度很高)，标准误差是0.014，95%可信区间为0.93～0.985。以2.25ng/ml作为截断点，血清MK的诊断结果与病理结果对照表如表3所示，171例患者中，MK的诊断结果提示为阳性的有53例，阴性118例，MK诊断的灵敏度、特异度及准确性分别为77.55%、87.70%及84.80%，阳性预测值为71.70%，阴性预测值为90.68%。

图1　血清MK的ROC曲线

表4　不同阈值诊断的灵敏度分析(例)

表5　不同阈值诊断的特异度分析(例)

3讨论

目前临床常用于评价甲状腺结节的检查方法主要有超声、CT、MRI、放射性核素显像和细针穿刺活检等，而血清学的检测一般主要是甲状腺激素水平，如总三碘甲状腺原氨酸(TT3)、总甲状腺素(TT4)、游离甲状腺原氨酸(FT3)、游离甲状腺素(FT4)、促甲状腺激素(TSH)、甲状腺微粒体抗体(TM-Ab)、甲状腺微粒体抗体(TPO-Ab)、甲状腺球蛋白抗体(TG-Ab)和甲状腺球蛋白(Tg)等。这些指标中Tg被认为[9，10]是分化型甲状腺癌术后复发或转移的肿瘤标志物，也有研究[10]认为Tg阴性时，TG-Ab可作为甲状腺癌术后复发或转移的监测指标，但Tg会受到激素水平、甲状腺的大小和损伤程度等影响，在甲状腺结节良恶性诊断中的作用一般[11]。

MK属于肝素结合生长因子，是由Kadomatsu等[12]于1988年发现在动物妊娠早中期羊水中检测到MK的浓度很高，其功能最初被定位于神经细胞的发育及分化。2000年Kato等[13]研究发现MK在正常甲状腺组织中几乎不表达，而在甲状腺乳头状癌中高表达，MK与甲状腺乳头状癌的恶性程度和BRAF基因突变有相关性[5，6]。Ikematsu等[14]采用ELISA法检测了10种不同类型的癌症患者的血清MK水平，发现在正常成人的血清中MK的含量却是有限的，在癌症患者的血清中MK的含量都偏高。

本研究中以MK=2.25ng/ml作为阈值诊断甲状腺恶性结节，其诊断的灵敏度、特异度及准确性分别为77.55%、87.70%及84.80%，而且MK在甲状腺恶性结节中浓度高，在良性结节和正常人血液中的浓度低，证实了其他学者的研究，血清中MK浓度的检测确实对甲状腺结节良恶性的诊断有一定的临床意义。本研究没有与影像学检查或其他血清指标进行对比研究，而且恶性结节病例数量和种类均有限，无法对MK浓度与不同类型的恶性结节相关性进行讨论。

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The Measurement and Clinical Significance of Midkine in Serum of Patients with Nodules

YANG Peng-fei,LI Juan,ZHANG Jian-zhong,et al

(DepartmentofNuclearMedicine,GeneralHospitalofNingXiaMedicalUniversity,YinchuanNingxia750004,China)

ABSTRACT：Objective To investigate the clinical significance of MK in the diagnosis of benign and malignant thyroid nodules in patients with benign and malignant thyroid nodules by analyzing the level of MK in patients with benign and malignant thyroid nodules. Methods Collect 171 patients who admission line resection because of thyroid nodule，collect 22 normal human serum whose indicators of healthy check-up are normal，use ELISA to detect the level of MK The serum was collected from 171 patients with “thyroid nodules” admitted to hospital, and the serum from 22 normal human was also collected.The concentration of MK was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results The level of MK in 122 patients with benign nodules was(1.54±0.57)ng/ml.The level of MK in 49 patients with malignant nodules was(3.46±1.44)ng/ml.The level of MK in normal control group was(1.44±0.45)ng/ml.The concentration of MK in the serum of malignant thyroid nodules group was significantly higher than that in benign nodules group，and there was a significant difference between the two groups.There was no significant difference in serum MK concentration between the benign thyroid nodules group and the controlgroup.ROC curve analysis had higher efficiency when it was used to diagnose the malignant thyroid nodules with 2.25ng/ml as the threshold value.Conclusion The serum levels of MK in patients with malignant thyroid nodules were significantly higher than those of benign nodules and normal people,and the serum MK level has a certain clinical significance in the diagnosis of benign and malignant thyroid nodules.

KEY WORDS：Thyroid nodule;Midkine;Pathology;ELISA

(收稿日期：2015-10-08)

DOI:10.16751/j.cnki.2095-4646.2016.01.0007

中图分类号：R736.1

文献标识码：A

文章编号：2095-4646(2016)01-0007-04

*通讯作者,E-mail：13909575176@126.com