张丽鑫, 王金涛, 杨永芳, 赵汉英

(1. 河北工业大学化工学院高分子科学与工程系, 天津 300130;

2. 南开大学化学学院, 天津 300071)



以二硫键连接的两嵌段共聚物的制备新方法

张丽鑫1, 王金涛2, 杨永芳1, 赵汉英2

(1. 河北工业大学化工学院高分子科学与工程系, 天津 300130;

2. 南开大学化学学院, 天津 300071)

摘要报道了一种制备二硫键连接的两嵌段共聚物的新方法. 以可逆加成-断裂链转移自由基聚合(RAFT)制备聚苯乙烯大分子链转移剂(PS-RAFT), 经伯胺还原得到巯基封端的PS(PS-SH). PS-SH与原子转移自由基聚合(ATRP)引发剂2-溴-2-甲基丙酸-2-(2-吡啶基二硫)乙酯发生交换反应, 得到含有二硫键的聚苯乙烯大分子ATRP引发剂(PS-S-S-Br). 以PS-S-S-Br引发甲基丙烯酸-2-羟基乙酯(HEMA)的ATRP聚合反应, 合成了由二硫键连接的两嵌段共聚物PS-S-S-PHEMA. 将PS-S-S-PHEMA可在甲醇中自组装形成以PS为核, PHEMA为壳的球形聚合物胶束, 为制备新型含二硫键聚合物提供了新的合成方法.

关键词二硫键; 嵌段聚合物; 自组装; 可逆加成-断裂链转移自由基聚合; 原子转移自由基聚合

近年来, 含有二硫键的聚合物作为基因和药物等的载体在生物化学及医学等领域得到广泛应用[1～5]. 二硫键在氧化性的细胞外环境中保持稳定, 而在还原性的细胞内环境中容易发生断裂. 研究发现, 肿瘤细胞中的还原性谷胱甘肽含量比正常血液环境高1000倍以上. 因此将二硫键引入药物控释体系中, 可实现药物的靶向释放[6～8].

由于本体及溶液中丰富的相结构及聚合物链的可断裂性, 以二硫键链接嵌段聚合物的制备备受关注. Zhang等[9]利用开环聚合与可控自由基聚合相结合的方法制备了二硫键链接的嵌段聚合物, 但这种方法只局限于己内酯及丙交酯等少数几种单体, 因此在单体的选择上受到极大限制. 本文结合可逆加成-断裂链转移自由基聚合(RAFT)[10]和原子转移自由基聚合(ATRP)[11]方法制备了以二硫键链接的嵌段聚合物. 通过RAFT制备聚苯乙烯(PS-RAFT), 经伯胺还原得到巯基封端的PS(PS-SH), 再通过巯基二硫键交换反应在聚合物末端引入2-溴-2-甲基丙酸-2-(2-吡啶基二硫)乙酯小分子ATRP引发剂, 得到含有二硫键的PS大分子ATRP引发剂(PS-S-S-Br), 最后通过ATRP聚合制备嵌段点为二硫键的聚苯乙烯-嵌段-聚甲基丙烯酸-2-羟基乙酯(PS-S-S-PHEMA). 利用RAFT聚合制备第一个嵌段后, 在将其末端转变为ATRP引发剂的同时引入了二硫键, 然后通过ATRP聚合获得了双嵌段聚合物. 这种方法在聚合过程中不受单体活性大小的限制, 具有可用单体广、反应条件温和以及聚合物结构可控等优点.

1实验部分

1.1试剂与仪器

苯乙烯(St, 分析纯, 去除阻聚剂后使用)和溴化亚铜(CuBr, 分析纯, 冰醋酸提纯, 乙醚洗涤后使用), 上海国药集团化学试剂有限公司; 甲基丙烯酸羟基乙酯(HEMA, 纯度≥98%, 除去阻聚剂后使用), 天津化学试剂批发公司; 偶氮二-4-腈基戊酸(ABCPA, 纯度97%, 重结晶后使用)、N,N,N′,N″,N″-五甲基二乙基三胺(PMDETA, 纯度99%)、二硫苏糖醇(DTT, 纯度98%)、二环己基碳二亚胺(DCC, 纯度98%)、4-二甲氨基吡啶(DMAP, 纯度98%)、巯基乙醇(纯度98%)、2-溴异丁酸和二硫二吡啶(纯度97%), Sigma-Aldrich 公司; 甲苯、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、无水乙醚、无水甲醇、冰醋酸和二氯甲烷, 分析纯, 天津市化学试剂六厂; 甲苯和DMF干燥蒸馏后使用.

AvanceⅢ400型核磁共振谱(1H NMR)仪, 瑞士Bruker公司; Varian PL型凝胶渗透色谱(GPC)仪, 日本日立公司; UV-2450型紫外-可见(UV-Vis)分光光度计, 日本岛津公司; Zetasizer Nano ZS电位仪, 英国马尔文公司; Tecani G2F20 S-TWIN型高分辨率透射电子显微镜(TEM), 美国FEI公司.

1.2端基含有二硫吡啶基团的小分子ATRP引发剂的制备

参照文献[12,13]方法合成2-溴-2-甲基丙酸-2-(2-吡啶基二硫)乙酯, 反应过程如Scheme 1所示. 将10 g(45 mmol)二硫二吡啶溶于90 mL甲醇和微量乙酸, 向其中缓慢滴入用10 mL甲醇稀释的1.55 mL(22 mmol)巯基乙醇溶液, 室温搅拌4 h. 反应停止后旋转蒸发除去溶剂, 再用乙酸乙酯溶解, 用高纯水洗涤3次, 萃取有机相, 用无水MgSO4干燥过夜. 通过色谱柱进行纯化, 得到2-吡啶二硫乙醇3.13 g, 产率为76%. 将0.7 g(3.74 mmol)2-吡啶二硫乙醇、0.97 g(4.49 mmol) DCC和54.8 mg(0.45 mmol) DMAP溶于二氯甲烷中, 搅拌下加入0.75 g(4.49 mmol) 2-溴异丁酸, 室温反应24 h. 过滤后旋干滤液, 用色谱柱进行纯化, 得到端基含有二硫吡啶基团的小分子ATRP引发剂2-溴-2-甲基丙酸-2-(2-吡啶基二硫)乙酯0.97 g, 产率为78%, 其结构用1H NMR表征(图S1, 见本文支持信息).

Scheme 1　Schematic illustration for the preparation of PS-S-S-PHEMA

1.3RAFT大分子链转移剂PS-RAFT的制备

参照文献[14,15]方法合成RAFT试剂4-腈基戊酸二硫代酯(CPADB), CPADB的化学结构式如Scheme 1所示. 以 CPADB为RAFT试剂, 偶氮二-4-腈基戊酸(ABCPA)为引发剂, 引发苯乙烯(St)的RAFT聚合[16]. 在Schlenk瓶中依次加入5.6 mg(0.2 mmol)CPADB, 0.8 mg(0.029 mmol)ABCPA, 13.8 mL(12.02 mmol)St和10 mL甲苯, 磁力搅拌使其溶解均匀. 反应体系用液氮冷冻, 抽真空-通氩气, 反复3次, 解冻后密封Schlenk瓶, 于85 ℃搅拌反应24 h. 液氮冷冻以终止反应, 浓缩产物, 在甲醇中沉淀3次, 真空干燥1 d, 即得PS-RAFT.

1.4PS-S-S-Br的制备

用正己胺还原PS-RAFT大分子末端的二硫酯基团, 将二硫酯氨解还原为巯基, 得到PS-SH[17], PS-SH再与2-溴-2-甲基丙酸-2-(2-吡啶基二硫)乙酯通过巯基-二硫交换反应制得PS-S-S-Br. 在Schlenk瓶中加入1 g(0.050 mmol)PS-RAFT, 用8 mL DMF溶解, 经过3次冷冻-抽真空-通氩气循环, 常温下解冻. 在氩气保护下快速加入374 μL(2.5 mmol)正己胺, 密封Schlenk瓶, 于35 ℃搅拌反应1 h. 在氩气氛围中浓缩反应液, 将沉淀加入甲醇中以除去正己胺. 快速离心取固体真空干燥, 即得PS-SH.

在Schlenk瓶中加入0.101 g(0.3 mmol)ATRP引发剂和10 mL DMF, 磁力搅拌溶解, 经液氮冷冻-抽真空-充氩气-解冻除氧, 在氩气保护下加入0.59 g(0.03 mmol)PS-SH, 密封反应瓶, 于35 ℃加热搅拌4 h. 在甲醇中沉淀以除去未反应的ATRP引发剂, 干燥后即得PS-S-S-Br.

1.5PS-S-S-PHEMA嵌段聚合物的制备

以PS-S-S-Br为大分子引发剂, 在35 ℃下以CuBr/PMDETA作催化剂, 引发HEMA单体的ATRP聚合[18], 制备PS-S-S-PHEMA嵌段聚合物. 在Schlenk瓶中加入0.7 g(0.035 mmol)PS-S-S-Br和0.416 g(3.2 mmol)HEMA, 用10 mL DMF溶解. 在另一个Schlenk瓶中加入6 mg(0.035 mmol)PMDETA, 用0.5 mL DMF溶解. 将2个Schlenk瓶分别用液氮冷冻, 抽真空-通氩气反复3次后解冻. 在氩气保护下向溶有PMDETA的Schlenk瓶中加入4 mg(0.028 mmol)CuBr, 密封, 搅拌, 络合1 h后将DMF溶解的铜盐溶液转移到单体溶液中, 再冷冻-抽真空-通氩气循环3次后解冻. 密封Schlenk瓶, 于35 ℃搅拌反应24 h. 通大气以终止反应, 反应液过硅胶柱除铜离子, 产物于无水乙醚中沉淀, 真空干燥至质量恒定, 即得PS-S-S-PHEMA嵌段聚合物(0.887 g).

将30 mg(0.00045 mmol)干燥的PS-S-S-PHEMA溶于2 mL DMF中, 加入7 mg(0.045 mmol)DTT, 室温搅拌反应24 h, 使嵌段聚合物的二硫键断开, 反应后在高纯水中沉淀, 干燥后用GPC测试分子量.

1.6PS-S-S-PHEMA的自组装

将PS-S-S-PHEMA嵌段聚合物配成8 mg/mL的DMF 溶液, 搅拌下用蠕动泵向4 mL聚合物溶液中缓慢滴加20 mL甲醇, 搅拌12 h即得稳定的聚合物胶束, 用DLS测量胶束粒径的大小和分布.

将聚合物胶束用甲醇稀释5倍后滴在镀有碳膜的铜网表面, 在铜网上形成薄层液膜, 待溶剂挥发后将铜网放于培养皿中经四氧化钌染色, 干燥后用TEM观察胶束的形貌.

2结果与讨论

2.1嵌段聚合物的表征

用1H NMR(CDCl3为溶剂)表征PS-RAFT, PS-SH和PS-S-S-Br的结构(图1). 图1谱线a中δ7.85, 7.41和7.33 处(峰d, f, e)的吸收峰为PS-RAFT末端与二硫酯相邻的苯环上5个质子的特征峰, 峰面积比约为2∶1∶2, 说明RAFT试剂已连接到聚苯乙烯大分子上;δ6.3～7.2处(c峰)的吸收峰对应聚苯乙烯苯环上氢的质子峰. 由峰c和峰d的积分面积比可计算PS的聚合度(DPPS=187)和分子量(Mn,NMR=19448), 计算公式如下:

DPPS=2Ic/5Id,Mn,NMR=DPPS×MSt

Fig.1　1H NMR spectra of PS-RAFT(a), 　PS-SH(b) and PS-S-S-Br(c)

式中,Ic和Id分别为峰c和峰d的积分面积,MSt为St单体的分子量. 图1谱线b中δ7.8～7.2处二硫酯末端苯环上5个质子的特征峰消失, 表明PS-RAFT被还原为PS-SH. 此外, PS-SH的生成还可通过巯基与二硫二吡啶(PySSPy)反应生成巯基吡啶得到证明. PySSPy与巯基的定量反应是测定巯基含量的标准方法[19]. PS-SH或PySSPy在λ=370 nm处均无吸收峰. 将1×10-6mol PS-RAFT还原得到的PS-SH与等摩尔 PySSPy反应, 生成的巯基吡啶在370 nm处吸光度为0.657(图2), 通过标准曲线计算可知生成的巯基吡啶为0.986×10-6mol, 即98%的PS-RAFT还原为PS-SH. 图1谱线c中δ4.07处(峰h)是PS-S-S-Br上与酯键相连的亚甲基质子的特征峰,δ3.5处(峰 g)是PS-S-S-Br上与二硫键相连的亚甲基质子的特征峰, 而图1谱线b中δ4.2～3.0处无峰, 表明已得到PS-S-S-Br. 将图1谱线c中峰c的积分面积设为图1谱线a中峰c的积分面积值, 由峰g和峰d的积分面积比可计算出95%的PS-RAFT转换成了PS-S-S-Br引发剂.

Fig.2　UV-Vis Spectra of PS-SH(a), PySSPy(b) and mixture of PS-SH and Py-SS-Py(c)

Fig.3　1H NMR spectra of PS-S-S-PHEMA

用1H NMR(DMSO-d6为溶剂)对PS-S-S-PHEMA进行表征(图3), PS和PHEMA重复单元上的特征峰同时出现. 其中,δ4.78, 3.89和3.56处的3个峰分别是PHEMA重复单元上羟基质子的特征峰(h)、与酯基相连的亚甲基质子的特征峰(f)及与羟基相连的亚甲基质子的特征峰(g).δ1.98～1.66及1.13～0.67的信号峰则是PHEMA主链上质子的特征峰(d, e). 通过峰h, f, g与δ7.24～6.25处的PS重复单元上苯环质子特征峰c的峰面积的比值可计算出PS-S-S-PHEMA的嵌段比例为1∶2, 即PHEMA的平均聚合度为361.

Fig.4　GPC curves of PS-RAFT(a), PS-S-S-Br(b), PS-S-S-PHEMA(c) and block copo-lymer after DTT treatment(d)Mobile phase is DMF.

以PS为内标, 以四氢呋喃(THF)为流动相时, PS-RAFT的GPC曲线见图S2(见本文支持信息), 所测PS-RAFT分子量(表S1, 见本文支持信息)与1H NMR测定结果较为一致. 图4为PS-RAFT, PS-S-S-Br, PS-S-S-PHEMA及经DTT断裂后的PS-S-S-PHEMA 的GPC曲线(DMF为流动相). 图4中曲线a,b和c均为单峰分布, 且PS-S-S-PHEMA的峰位相对于PS-S-S-Br明显移向相对分子量更大的位置(流出时间更短) , 说明制得了PS-S-S-PHEMA两嵌段聚合物, 而不是 PHEMA 和PS两种均聚物的混合物. DTT断链后出现明显的双峰分布(曲线d), 且小分子量的峰对应于初始PS的峰, 证明了PS-S-S-PHEMA嵌段点为二硫键, 且加入DTT后二硫键断裂.

2.2PS-S-S-Br引发HEMA单体的聚合动力学行为

为了研究 PS-S-S-Br大分子ATRP引发剂的聚合效率, 以PS-S-S-Br为引发剂, CuBr/PMDETA为催化剂, 考察了HEMA单体进行ATRP 聚合的动力学特性. 在不同的聚合时间进行取样, 冷冻终止反应, 得到不同的PS-S-S-PHEMA嵌段聚合物. PS-S-S-PHEMA嵌段共聚物的GPC曲线如图5(A)所示. 图5(B)给出数均分子量(Mn)及分子量分布(PDI)随聚合反应时间的变化关系. 由图5(B)可见, 嵌段聚合物PS-S-S-PHEMA的Mn随时间增加而呈现线性增长, PDI较窄, 说明聚合反应具有活性特征.

Fig.5　GPC curves of PS-S-S-PHEMA at different polymerization time(A) and 　dependence of Mn and PDI on polymerization time(B)

2.3PS-b-PHEMA自组装胶束的表征

Fig.6　DLS curves of PS-S-S-PHEMA micelles in methanol(a), PS-S-S-PHZMA micelles treated with DTT for 6 h(b) and 24 h(c)

图6为PS-S-S-PHEMA在甲醇和DMF混合溶剂中自组装成胶束的动态光散射(DLS)曲线. 嵌段共聚物在DMF中完全溶解, 而甲醇是PS链段的沉淀剂, 是PHEMA链段的良溶剂. 随着甲醇的加入, 聚苯乙烯链逐渐塌陷, 而PHEMA链则始终保持伸展状态, 因此形成聚合物胶束[20,21]. DLS结果表明, 聚合物胶束成单峰分布, 胶束尺寸为22 nm, PDI为0.086, 说明聚合物胶束尺寸分布很窄. 向胶束溶液中加入过量的DTT可使二硫键断裂, 反应6 h后的DLS结果表明, 胶束的直径增大到32 nm, 并产生200～1000 nm的聚集体. 随着断键反应的进行, 胶束溶液逐渐浑浊. 24 h后, 聚集体的粒径增大到1 μm以上. 这是因为随着二硫键的断裂, PHEMA链从胶束核上脱离, 破坏了聚合物胶束的稳定性, 导致聚苯乙烯链段相互团聚, 形成尺寸较大的聚集体.

图7(A)是PS-S-S-PHEMA在甲醇溶液中的TEM照片. 可以看出, 在甲醇溶液中PS-S-S-PHEMA胶束呈现球形结构且尺寸分布较窄. 胶束粒子的平均尺寸为20 nm左右, 与DLS测试结果相近. 用激光笔照射PS-S-S-PHEMA胶束溶液, 发现有明显的丁达尔现象[如图7(B)]. 加入DTT的胶束溶液可观察到尺寸较大的胶束聚集体[如图8(A)]. 断链后的胶束溶液静置24 h后, 形成肉眼可见的白色絮状颗粒物沉淀, 上层溶液澄清透明[如图8(B)]. 证明PS-S-S-PHEMA嵌段共聚物是通过二硫键相连接, 加入DTT后, 二硫键断裂而导致胶束结构破坏, 聚合物聚集成尺寸较大的聚集体.

Fig.7　TEM image of PS-S-S-PHEMA micelle in methanolInset: tyndall effect of PS-S-S-PHEM micelle in methanol.

Fig.8　TEM image of PS-S-S-PHEMA micelle in methanol after DTT treatmentInset: photograph of precipitation of PS-S-S-PHEMA.

综上所述, 本文利用RAFT和ATRP聚合的方法, 制备了由二硫键连接的PS-S-S-PHEMA嵌段聚合物. 获得分子量可控的两亲性嵌段共聚物. 两亲性嵌段共聚物在选择性溶剂中可以自组装形成胶束, 胶束是直径约为20 nm且为粒径分布较窄的球形结构. 当用DTT将PS-S-S-PHEMA的二硫键断键后, 胶束会被解体从而形成尺寸较大的聚集体. 这类聚合物组装体可应用于药物控制释放及生物显影技术等方面.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20150570.

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Novel Method of Preparation of Diblock Copolymers with

Disulfide Bonds at Junction Points†

ZHANG Lixin1, WANG Jintao2, YANG Yongfang1, ZHAO Hanying2*

(1.InstituteofPolymerScienceandEngineering,SchoolofChemicalEngineeringandTechnology,

HebeiUniversityofTechnology,Tianjin300130,China;

2.CollegeofChemistry,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)

AbstractSynthesis of diblock copolymers containing disulfides at the junction points was reported. Rever-sible addition-fragmentation chain transfer(RAFT) polymerization of styrene was employed to prepare polystyrene marco RAFT agent(PS-RAFT). The terminal RAFT agents of PS were reduced to sulfhydryl groups(PS-SH) in the presence of primary amine, and the atom transfer radical polymerization(ATRP) macroinitiator(PS-S-S-ATRP) was prepared by an exchange reaction between PS-SH and an ATRP initiator containing disulfide bonds. PS-S-S-ATRP was used to initiate the polymerization of 2-hydroxyethyl methacrylate(HEMA) and PS-S-S-PHEMA diblock copolymers with disulfides at the junction points were obtained. The structures and molecular weights of the diblock copolymers were characterized by proton nuclear magnetic resonance(1H NMR) and gel permeation chromatography(GPC). Kinetics study of ATRP of HEMA shows the characteristic of living polymerization. In methanol, the diblock copolymer self-assembles into polymeric micelle with PS cores and PHEMA coronae. Transmission electron microscopy and dynamic light scattering were used to study the morphology changes of the micelles after cleavage of the disulfide bonds. The result shows a new methd to prepare block copolymers with disulfide bonds at the junction points. The self-assenbly strecture of the copolymers will have a wide application in drug release and biological imaging techniques.

KeywordsDisulfide bond; Diblock copolymer; Self-assembly; Reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization; Atom transfer radical polymerization

(Ed.: W, Z)

† Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.51473079).

doi:10.7503/cjcu20150567

基金项目：国家自然科学基金(批准号: 51473079)资助.

收稿日期:2015-07-22. 网络出版日期: 2015-12-20.

中图分类号O633.3

文献标志码A

联系人简介: 赵汉英, 男, 博士, 教授, 主要从事聚合物的合成与应用研究. E-mail: hyzhao@nankai.edu.cn