阳松威， 郭建生，2*， 王晓倩， 刘顶鼎， 黄琳桂（.湖南中医药大学中药现代化研究重点实验室，湖南长沙40208；2.湖南中医药大学药学院，湖南长沙40208）



补肾疗更浸膏对去势更年期模型大鼠神经内分泌功能失调的作用

阳松威1， 郭建生1，2*， 王晓倩1， 刘顶鼎1， 黄琳桂1
（1.湖南中医药大学中药现代化研究重点实验室，湖南长沙410208；2.湖南中医药大学药学院，湖南长沙410208）

网络出版日期：2015-06-30

网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detai1/31.1368.I.20150630.1331.001.htm1

摘要：目的 研究补肾疗更浸膏对去势更年期模型大鼠神经内分泌功能失调的治疗作用及其作用机制。方法 通过手术摘除雌性SD大鼠双侧卵巢复制更年期综合征模型。模型成功后，将其随机分为空白组，假手术组，模型组，戊酸雌二醇片组，坤泰胶囊组，补肾疗更浸膏低、中、高剂量组。末次给药24 h后，腹主动脉取血ELISA法测定血清雌二醇（E2）、促性腺激素释放激素（GnIH）、促黄体生成素（LH）、促卵泡激素（FSH）、睾酮（T）水平；取下丘脑测定多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、5-羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）水平；取双侧子宫称湿重计算脏器指数；于10%甲醛溶液中固定，观察其病理学改变。结果 补肾疗更浸膏可有效升高模型大鼠血清E2（P＜0.05，P＜0.01）水平，降低GnIH（P＜0.05，P＜0.01）、LH（P＜0.05，P＜0.01）、FSH（P＜0.05）、T（P＜0.05，P＜0.01）水平，有效降低下丘脑单胺类神经递质DA（P＜0.05，P＜0.01）、NE（P＜0.05，P＜0.01）、5-HT （P＜0.05，P＜0.01）、5-HIAA（P＜0.05，P＜0.01）水平，并可升高模型大鼠子宫系数（P＜0.05），增加子宫内膜厚度（P＜0.05）。结论 补肾疗更浸膏可通过调节血液性激素与下丘脑单胺类神经递质水平，增强子宫功能，改善去势模型大鼠下丘脑-垂体-内分泌轴与植物神经功能的紊乱状态，从而有效稳定机体内环境，改善更年期神经内分泌系统功能，缓解更年期症状。

关键词：补肾疗更浸膏；更年期；神经内分泌系统；作用机制

更年期综合征（menopausa1 syndrome，MPS），是指更年期妇女由于卵巢功能衰退，体内雌激素（E2）分泌减少，代偿性引起促性腺激素（LH、FSH）分泌增加，导致机体内分泌功能紊乱，并伴有植物神经功能失调的一组复杂症候群。常见症状有烘热汗出、烦躁易怒、心悸失眠、腰膝酸软等，往往伴随出现，持续时间长短不一［1-2］。调查发现我国超过80%的更年期女性出现上述症状，严重影响生活和工作，危害妇女身心健康［3］。现代医学主要采用雌激素替代疗法（HIT）对该病进行治疗，但是有增加患心脏病、脑卒中、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌风险的可能，因而其使用受到各界争议［4］。相比而言，祖国传统医学对该病的治疗具有丰富临床经验，对其药效与机制的研究亦取得积极成果，与HIT比较具有疗效确切、副作用少等优点，因此该领域相关研究越来越受到人们的关注。

补肾疗更浸膏由熟地黄、肉苁蓉、锁阳、党参、龙骨、赤芍、茯苓、益母草、阿胶、紫河车10味中药组成，具有补肾填精、益气活血之功效，临床使用对更年期综合征具有良好疗效。本研究以手术摘除SD大鼠双侧卵巢复制更年期模型，通过研究补肾疗更浸膏对更年期模型大鼠血清性激素与下丘脑单胺类神经递质以及子宫的影响及其作用机制，探讨补肾疗更浸膏对更年期神经内分泌功能失调的干预作用，从而为其治疗更年期综合征的临床应用提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 实验动物 SD大鼠，SPF级，雌性，体质量180～220 g，许可证号SCXK（湘）2011-0003，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

1.2 药物和试剂 补肾疗更浸膏（湖南省中医药研究院，每1 g浸膏粉含生药量3.3 g，批号20140605）；戊酸雌二醇片（德国拜耳医药保健有限公司，批号113A）；坤泰胶囊（贵阳新天药业股份有限公司，批号140507）；水合氯醛（国药集团化学试剂有限公司，批号20130426）；甲醛（天津市百世化工有限公司，批号20130805）；氯化钠注射液（河北天成药业股份有限公司，批号A14010409）；注射用青霉素钠（华北制药股份有限公司，批号J3102101）。大鼠ELISA试剂盒，含雌二醇（批号E-73209）、促卵泡激素（批号E-15759）、促黄体激素（批号E-16207）、促性腺激素释放激素（批号E-30618）、睾酮（批号E-73208）、多巴胺（批号E-11532）、去甲肾上腺素（批号E-16571）、5-羟色胺（批号E-75118）、5-羟吲哚乙酸（批号E-10548），均由美国I&D公司提供；BCA蛋白定量试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，批号00061410）。

1.3 仪器 TGL-16型台式冷冻离心机（湖南湘仪离心机仪器有限公司）；PW-812型全自动酶标洗板机（深圳市汇松科技发展有限公司）；MB-530型酶标仪（深圳市汇松科技发展有限公司）；THZ-C型恒温震荡器（太仓市强乐实验设备有限公司）；IM2235型轮转石蜡切片机（德国徕卡公司）；YD-A型生物组织摊片机（金迪公司）；BCD-226SKA型冰箱（青岛海尔股份有限公司）；MTIC B型光学显微镜（Motic公司）；FB223型自动内校电子分析天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；LD型电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）。

2 方法

2.1 更年期综合征大鼠模型的建立［5-6］取SD雌性大鼠80只，按体质量与随机数字表随机分为空白组（10只）、假手术组（10只）、模型组（60只），参照文献方法，手术摘除模型组大鼠双侧卵巢。每只大鼠分别以10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，腹位固定，于最末肋骨下，距中线和脊柱外侧约2 cm交叉处剪毛，切开皮肤和背肌约1.5～2 cm，切口视野中可见一乳白色发亮的脂肪团，卵巢即包埋其中，用小镊子轻轻夹住脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，便可见到一团细线状不规则呈黄红色的卵巢。先将卵巢下输卵管与脂肪用细线结扎，再摘除卵巢，随即将子宫角送回腹腔中，缝合肌肉及皮肤，同法摘除另一侧卵巢，术后连续青霉素处理5 d以防感染。术后第6天开始连续5 d进行阴道细胞涂片检查，以确定卵巢摘除完全，具体操作为左手常规捉拿动物，右手取一钝头滴管，吸入生理盐水0.2 mL，轻轻插入阴道2～3 cm，反复抽吸2～3次，取出滴管，将阴道冲洗液滴于载玻片上，自然风干后光学显微镜镜检。假手术组不摘除卵巢，仅切除卵巢周围部分脂肪组织；空白组不做任何处理。

2.2 分组及给药 造模成功以后，将模型组大鼠随机分为模型组，戊酸雌二醇片组（0.000 18 g/kg），坤泰胶囊组（1.08 g/kg），补肾疗更浸膏低、中、高剂量组（4.5、9、18 g/kg，分别相当于临床等效剂量1、2、4倍），每组10

只。各组均按10 mL/kg体积灌胃给药，空白组、假手术组与模型组只给予等量蒸馏水，每天1次，连续4周。

2.3 指标检测方法

2.3.1 对更年期模型大鼠血清性激素E2、GnIH、LH、FSH、T水平测定 于末次给药24 h后，以10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉采血，室温静置40 min后，以3 000 r/min离心15 min，制备血清，液氮保存。参照试剂盒说明书步骤，采用ELISA法测定大鼠血清中E2、GnIH、LH、FSH、T的含有量。

2.3.2 对更年期模型大鼠下丘脑单胺类神经递质DA、NE、5-HT、5-HIAA水平测定 大鼠腹主动脉取血后，沿头部枕骨大孔处剪断大脑，迅速在冰盘上剥离全脑并分离下丘脑组织。参照试剂盒说明书步骤，BCA法蛋白定量后，采用ELISA法测定下丘脑单胺类神经递质DA、NE、5-HT、5-HIAA的水平。

2.3.3 对更年期模型大鼠子宫组织病理学切片检测 剖开大鼠腹腔，取下双侧子宫，剥离子宫周围附着的脂肪组织，并迅速用分析天平准确称取湿重，计算脏器指数。随即用10%甲醛溶液浸泡固定，石蜡包埋，连续切片，HE染色，用测微尺测量子宫内膜厚度。

2.3.4 统计学分析 实验数据采用SPSS 19.0软件分析，数据用“±s”表示。组间比较，计量资料首先作正态性和方差齐性检验，满足方差齐性，采用one-way ANOVA进行方差分析；不满足方差齐性，采用非参数法检验。以P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

3 结果

3.1 补肾疗更浸膏对去势更年期模型大鼠血清性激素E2、Gn IH、LH、FSH、T水平的影响 与空白组、假手术组比较，模型组大鼠血清E2水平明显降低（P＜0.01），Gn IH、LH、FSH、T水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01），空白组与假手术组比较，相关性激素水平差异无统计学意义（P＞0.05），提示造模成功。经补肾疗更浸膏治疗后，与模型组比较，补肾疗更浸膏高剂量组大鼠血清E2水平明显升高（P＜0.01），GnIH、LH、FSH、T水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01）；中剂量组大鼠血清E2水平明显升高（P＜0.05），GnIH、LH、FSH、T水平明显降低（P＜0.05）。提示补肾疗更浸膏可有效调节去势模型大鼠血液性激素水平，改善更年期内分泌功能紊乱状态。结果见表1。

表1 补肾疗更浸膏对去势更年期模型大鼠血清性激素E2、GnRH、LH、FSH、T水平的影响（±s，n＝10）

表1 补肾疗更浸膏对去势更年期模型大鼠血清性激素E2、GnRH、LH、FSH、T水平的影响（±s，n＝10）

注：与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别　　剂量/（g·kg-1）E2/（pg·mL-1）LH/（m IU·m L-1）FSH/（m IU·mL-1）GnIH/（pg·mL-1）　T/（ng·mL-1）空白组　　—235.85±62.14　 5.83±1.42　5.08±1.85　 23.72±8.22　3.22±1.21假手术组　　—　234.67±59.14　 5.82±1.45　5.06±1.85　 23.57±7.95　3.17±1.16模型组　　—　161.59±33.26△△##7.87±1.28△△##　7.40±1.72△#35.36±8.62△△##　5.27±1.45△△##戊酸雌二醇片组　0.000 18　 218.65±40.69**　5.78±1.10**　4.98±1.39**23.11±5.87**　3.26±0.81**坤泰胶囊组　1.08　203.46±34.96*　6.26±0.97*　5.58±1.24*　25.53±5.19*　3.59±0.71*补肾疗更浸膏低剂量组　4.5　192.96±22.05　 7.05±2.91　6.81±4.16　 30.52±17.64　4.86±3.59补肾疗更浸膏中剂量组　9　207.23±14.98*　6.21±0.57*　5.50±0.73*　25.10±3.07*　3.53±0.42*补肾疗更浸膏高剂量组　18　213.29±58.29**　5.90±0.97**　5.13±1.22*　23.65±5.10**　3.33±0.70**

3.2 补肾疗更浸膏对去势更年期模型大鼠下丘脑单胺类神经递质DA、NE、5-HT、5-HIAA水平的影响 与空白组、假手术组比较，模型组大鼠下丘脑DA、NE、5-HT、5-HIAA水平明显升高（P＜0.01），空白组与假手术组比较，其差异无统计学意义（P＞0.05），提示造模成功。经补肾疗更浸膏治疗后，与模型组比较，补肾疗更浸膏高剂量组大鼠下丘脑DA、NE、5-HT、5-HIAA水平明显降低（P＜0.01）；中剂量组大鼠下丘脑DA、NE、5-HT、5-HIAA水平明显降低（P＜0.05、P＜0.01）；低剂量组大鼠下丘脑5-HT水平明显降低（P＜0.05）。提示补肾疗更浸膏可调节去势大鼠下丘脑单胺类神经递质水平，恢复其正常水平，改善更年期紊乱的植物神经功能。结果见表2。

表2 补肾疗更浸膏对去势更年期模型大鼠下丘脑单胺类神经递质DA、NE、5-HT、5-HIAA水平的影响（±s，n＝10）

表2 补肾疗更浸膏对去势更年期模型大鼠下丘脑单胺类神经递质DA、NE、5-HT、5-HIAA水平的影响（±s，n＝10）

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别　　剂量/（g·kg-1）5-HT/（ng·mg-1）　5-HIAA/（ng·mg-1）　 DA/（ng·mg-1）　NE/（pg·mg-1）空白组　　—3.23±0.16　34.70±4.64　15.34±1.42　17.08±3.53假手术组　　—　3.17±0.22　33.42±3.51　15.52±1.31　16.70±3.40模型组　　—　3.55±0.36△△##　39.12±2.94△△##　17.33±1.39△△##　21.68±2.76△△##戊酸雌二醇片组　0.000 18　3.10±0.25**　33.16±3.40**　14.81±2.31**　17.11±3.01**坤泰胶囊组　1.08　3.21±0.19**　34.96±2.96*　16.06±0.88*　18.42±2.30*补肾疗更浸膏低剂量组　4.5　3.36±0.29**　36.49±6.75　16.62±1.22　20.16±6.52补肾疗更浸膏中剂量组　9　3.24±0.16*　34.73±1.90*　15.93±1.00*　18.24±1.39*补肾疗更浸膏高剂量组　18　3.20±0.18*　34.10±2.85**　15.39±1.99**　17.66±2.28**

3.3 补肾疗更浸膏对去势更年期模型大鼠子宫系数、子宫内膜厚度的影响 与空白组、假手术组比较，模型组大鼠子宫系数明显降低（P＜0.01），子宫内膜厚度明显减小（P＜0.01），提示造模成功。经补肾疗更浸膏治疗后，补肾疗更浸膏高剂量组大鼠子宫系数明显升高（P＜0.05），子宫内膜厚度明显增加（P＜0.05）。提示补肾疗更浸膏可有效增加去势大鼠子宫湿重与子宫内膜厚度，增强子宫功能。结果见表3及图1。

表3 补肾疗更浸膏对去势更年期模型大鼠子宫系数、子宫内膜厚度的影响（±s，n＝10）

表3 补肾疗更浸膏对去势更年期模型大鼠子宫系数、子宫内膜厚度的影响（±s，n＝10）

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与假手术组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05

组别　　剂量/（g·kg-1）　　子宫系数/［g·（100 g）-1］　　子宫内膜厚度/μm空白组　　—0.204±0.022　1 052.561±199.556假手术组　　—　0.191±0.018　1 037.166±201.745模型组　　—　0.040±0.006△△##　670.257±214.554△△##戊酸雌二醇片组　0.000 18　0.052±0.010*　842.290±208.118*坤泰胶囊组　1.08　0.051±0.009　824.581±184.649补肾疗更浸膏低剂量组　4.5　0.047±0.006　745.072±111.113补肾疗更浸膏中剂量组　9　0.049±0.009　832.650±155.858补肾疗更浸膏高剂量组　18　0.052±0.007*　880.877±224.413*

图1 补肾疗更浸膏对去势模型大鼠子宫的影响（HE，×200）

4 讨论

更年期综合征是困扰大多数中老年妇女的常见疾病之一，其基本机理是卵巢功能衰退，性激素分泌失调，引起内分泌功能紊乱，并伴随下丘脑单胺类神经递质含有量异常，使得下丘脑-垂体-卵巢轴平衡发生变化，引发神经内分泌系统失调，出现诸如潮热汗出、心悸失眠等症状在内的以植物神经功能紊乱为主，同时伴有精神心理症状的一组症候群［7-8］。

研究表明，卵巢的分泌活动受到下丘脑、垂体的调控，而卵巢分泌的激素使子宫内膜发生周期性变化，从而出现动情周期，同时体内激素又对下丘脑、垂体进行反馈调节。卵巢功能发生退行性改变后，体内雌激素水平下降，对下丘脑-垂体系统的负反馈调节作用减弱，诱导下丘脑弓状核和室旁核脉冲式分泌促性腺激素释放激素（GnIH）至门脉循环系统，刺激垂体FSH、LH分泌增加，导致下丘脑-垂体-卵巢轴功能紊乱［9-10］。实验发现，大鼠切除卵巢后，血液中雌激素E2含有量明显降低，对下丘脑-垂体的负反馈作用减弱，代偿性使FSH、LH含有量升高，同时T水平亦升高，而补肾疗更浸膏能有效升高更年期模型大鼠血液中E2水平（P＜0.05，P＜0.01），降低GnIH、LH、FSH水平（P＜0.05，P＜0.01），对T的含有量也有降低作用（P＜0.05，P＜0.01），使之趋于正常水平，同时能提高模型大鼠子宫系数（P＜0.05），增加子宫内膜厚度（P＜0.05），增强子宫功能，从而表现出良好的调节下丘脑-垂体-卵巢轴的作用，改善更年期综合征紊乱的内分泌与生殖功能。

神经递质在神经细胞间及神经细胞与内分泌、免疫系统之间信息传递起着重要作用，下丘脑神经递质对GnIH的释放具有重要调节作用。其中以单胺类神经递质为主，包括儿茶酚胺类（NE、DA）和吲哚类（5-HT、5-HIAA）影响最为明显［11］。据报道5-HT、NE等的代谢异常与精神情志密切相关，5-HT是控制情绪的主要物质，影响生理和心理功能，而NE在中枢参与觉醒、意识、情感、生殖等方面的调节［12］。因此下丘脑单胺类神经递质水平失调会导致机体植物神经功能失常，影响患者情志与正常生理功能，产生诸如失眠多梦、烦躁不安等更年期症状。实验发现，去势模型大鼠下丘脑5-HT、5-HIAA含有量明显升高，NE、DA水平亦升高，分析可能与内分泌失调导致交感神经异常兴奋有关，补肾疗更浸膏可有效降低下丘脑单胺类神经递质水平（P＜0.05，P＜0.01），改善下丘脑-垂体功能紊乱状态，调节更年期植物神经功能。

雌激素替代疗法（HIT）是目前治疗更年期综合征常用治疗方案，临床使用可以显著改善潮热、出汗、失眠等症状，提高患者生活质量［13］。但是激素疗法不适用有激素禁忌证的患者，如有激素相关恶性肿瘤、乳腺癌、肝肾功能障碍，或者子宫内膜异位症、子宫肌瘤、高血压及糖尿病，同时也会产生心血管与生殖系统方面的副作用，因而限制了其使用［14］。因此，能改善更年期症状的其他临床研究、药物的开发及医疗措施今年来受到医药界普遍关注［15］。中医药对更年期综合征的治疗具有丰富的临床经验，历史古籍虽对其无专篇阐述，但大都散见于各医学典籍中，对其症状、机理都有详尽描述，诸如“脏躁”、“百合病”、“经水过期不止”等。普遍认为该病属本虚标实、虚实夹杂之证，治宜滋补肝肾为本，根据辨证，兼加祛痰、解郁、泻火等法［16］。

本实验所研究中药六类新药补肾疗更浸膏具补肾填精、益气活血之功效，能有效调节因卵巢功能衰退导致的内分泌功能失调，纠正下丘脑单胺类神经递质紊乱，调节去势模型大鼠下丘脑-垂体-卵巢轴功能，改善更年期紊乱的植物神经功能，从而稳定机体内环境，起到缓解更年期症状的作用，为其临床使用提供一定的实验依据。

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doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.03.036

中图分类号：I285.5

文献标志码：B

文章编号：1001-1528（2016）03-0651-04

*通信作者：郭建生（1953—），男，教授，博士生导师，从事中药药性理论与中药新药研究。Te1：（0731）88458239，E-mai1：gjs7878@126.com

作者简介：阳松威（1990—），男，硕士生，从事中药新药研究与开发。Te1：15200832653，E-mai1：646972015@qq.com

基金项目：湖南省中药学重点学科（2014）

收稿日期：2015-04-29