温见翔，杨虹（北京大学深圳医院，广东深圳518036）



四种外排泵抑制剂逆转阴沟肠杆菌耐药性效果比较

温见翔，杨虹
（北京大学深圳医院，广东深圳518036）

摘要：目的 比较四种外排泵抑制剂碳氰间氯苯腙（CCCP）、利血平维拉帕米奥美拉唑逆转阴沟肠杆菌耐药性的效果。方法 收集多重耐药阴沟肠杆菌36株，采用E-test方法检测头孢曲松、庆大霉素、环丙沙星、氨曲南对菌株的最低抑菌浓度（MIC），再分别检测加入CCCP、利血平维拉帕米奥美拉唑后菌株对抗菌药物的MIC，加入外排泵抑制剂后，MIC下降4倍或以上者判断为外排阳性。结果 加入外排泵抑制剂后，筛选外排阳性株阳性率由高到低依次为CCCP 34．72%、利血平13．89%、奥美拉唑9．72%、维拉帕米5．56%；环丙沙星加入CCCP后外排阳性株数量最多，阳性率为58．33%。结论 四种外排泵抑制剂均可不同程度地逆转阴沟肠杆菌的耐药性，CCCP逆转阴沟肠杆菌的耐药性效果最佳。

关键词：阴沟肠杆菌；碳氰间氯苯腙；利血平；维拉帕米；奥美拉唑

阴沟肠杆菌是临床常见的条件致病菌之一，是医院获得性感染的重要病原菌。随着广谱抗菌药物的广泛使用，阴沟肠杆菌在抗菌药物的选择性压力下出现高耐药性和多重耐药［1，2］。本研究对碳氰间氯苯腙（CCCP）、利血平维拉帕米奥美拉唑四种外排泵抑制剂逆转阴沟肠杆菌耐药性的效果进行比较，为多重耐药阴沟肠杆菌感染的治疗提供依据。

1　材料与方法

1．1材料 收集2010年5月～2013年6月北京大学深圳医院患者痰液、尿液、血液、脓液、胆汁等标本中分离的多重耐药阴沟肠杆菌36株［3］。使用Micro ScanWalkaway40细菌分析仪进行鉴定和药敏试验，同一患者同一部位分离出的阴沟肠杆菌，如药敏结果相同，仅采用首次分离菌株。以大肠杆菌

ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853为质控菌株，药敏结果依据CLSI（2013年）临床微生物实验室标准判定。头孢曲松、庆大霉素、环丙沙星、氨曲南E-test药敏试纸和光度比浊仪为法国梅里埃生物公司产品；CCCP购自Sigma公司，利血平购自广东邦民制药厂，维拉帕米购自上海禾丰制药有限公司，奥美拉唑购自陕西博森生物制药厂。

1．2外排泵抑制剂工作浓度的确定 采用外排泵抑制剂的抑菌试验。分别配制含有不同终浓度外排泵抑制剂的MH琼脂平板，其中CCCP的终浓度分别为5、10、15、20 μg／mL；利血平、维拉帕米、奥美拉唑的终浓度分别为20、40、60、80 μg／mL。分别将大肠杆菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853及36株多重耐药阴沟肠杆菌接种含有不同终浓度外排泵抑制剂的MH琼脂平板，以不含任何外排泵抑制剂的MH琼脂平板做为空白对照。37℃培养16 ～18 h，观察各菌株在含有不同终浓度外排泵抑制剂的MH琼脂平板的生长情况，以各菌株不受抑制、生长良好的外排泵抑制剂最高浓度作为其工作浓度。最终确定CCCP、利血平、维拉帕米、奥美拉唑的工作浓度分别为10、40、60、60 μg／mL。

1．3外排泵抑制剂逆转阴沟肠杆菌耐药性作用观察 采用E-test方法分别测试36株阴沟肠杆菌对头孢曲松、庆大霉素、环丙沙星及氨曲南的MIC。相同方法分别检测加入CCCP、利血平维拉帕米奥美拉唑后，阴沟肠杆菌对孢曲松、庆大霉素、环丙沙星和氨曲南的MIC。加入外排泵抑制剂后MIC下降4倍或以上判断为外排阳性。

1．4统计学方法 采用SPSS17．0统计软件。计数资料的比较采用χ2检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2　结果

3　讨论

细菌的外排系统是通过细菌主动外排泵将扩散入菌体内的药物或其他底物排出膜外，从而加强细菌在药物选择压力下的生存能力，它是细菌的一种非特异性耐药机制［4］。耐药结节细胞分化家族AcrAB-TolC外排系统是导致革兰阴性菌多重耐药的重要因素［5～7］。阴沟肠杆菌染色体上存在AcrA、AcrB、AcrR、TolC基因，可以编码AcrAB-TolC外排泵［8］，多重耐药的阴沟肠杆菌存在活跃的AcrABTo1C外排泵，阴沟肠杆菌多重耐药与主动外排系统有关［9～11］。我们的前期研究显示，我院临床分离的阴沟肠杆菌高水平携带AcrAB-TolC系统的AcrA、AcrB、AcrR、TolC四种基因［3］。外排泵抑制剂不仅可以抑制耐药细菌对药物的外排，恢复其对药物的敏感性，而且可以改善某些药物的药动学特性（如提高口服药物的吸收率，改善肝、肾清除率）［12］。本研究选取了头孢菌素类的头孢曲松、氨基糖苷类的庆大霉素、喹诺酮类的环丙沙星以及单环酰胺类的氨曲南作为外排泵底物，观察外排泵抑制剂CCCP、利血平、维拉帕米、奥美拉唑对36株多重耐药阴沟肠杆菌MIC的影响。结果显示，加入外排泵抑制剂后，筛选外排阳性株阳性率由高到低依次为CCCP、利血平、奥美拉唑、维拉帕米。四种外排泵抑制剂与庆大霉素和环丙沙星联合应用后，逆转细菌耐药性的效果较好。环丙沙星加入CCCP后筛选阳性菌株最多，阳性率为55．56%，庆大霉素亦是与CCCP联合使用后筛选的阳性率最高（47．22%）。外排泵抑制剂对头孢曲松MIC的影响最小，与CCCP联合应用时仅出现3株阳性菌株，而与利血平、维拉帕米作用后均未出现阳性株。氨曲南与外排泵抑制剂共同作用后，仅有6株外排阳性菌株。分析其原因可能是阴沟肠杆菌对头孢类和单环酰胺类抗菌药物的耐药机制主要是在抗菌药物的诱导下，细菌产生β-内酰胺酶，包括AmpC酶、超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和碳青霉烯酶等［13］。AmpC酶可水解三代头孢菌素而不被β-内酰胺酶抑制剂所抑制，ESBLs能够灭活三代头孢菌素和氨曲南等抗菌药物。而主动外排系统在阴沟肠杆菌对头孢类和单环酰胺类抗菌药物耐药作用较小。

综上所述，四种外排泵抑制剂对我院分离的多重耐药阴沟肠杆菌均有不同程度耐药逆转作用，CCCP逆转阴沟肠杆菌的耐药效果最佳。外排泵抑制剂与抗菌药物联合使用为逆转细菌耐药提供了新的思路，但由于CCCP、利血平、维拉帕米、奥美拉唑的实验剂量远大于临床常用剂量，不良反应较大，因此目前仅限于体外实验，能否用于临床仍需进一步研究。

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收稿日期：（2015-08-24）

基金项目：广东省深圳市科技计划项目（201203016）。

中图分类号：R378．2

文献标志码：B

文章编号：1002-266X（2016）02-0064-02

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．027