金琦，蔡天蕊，黄朔，何其勇，孙玉鸿（佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002）



黄芩对急性重症胰腺炎大鼠肝损伤的预防及治疗作用研究*

金琦，蔡天蕊，黄朔，何其勇，孙玉鸿
（佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154002）

摘要：目的研究黄芩（Bai）对急性重症胰腺炎（ASP）大鼠肝损伤的预防及治疗作用。方法选取Sprague Dawley大鼠36只，随机分为正常组、ASP组、制模前应用黄芩ASP组（Bai前ASP组）、制模后应用黄芩ASP组（Bai后ASP组）、制模前后均应用ASP组（Bai前后ASP组）、头孢哌酮ASP组（抗生素ASP组）。制模给药24和48h后进行血淀粉酶（AMY）、谷丙转氨酶(ALT）、白细胞介素-6（IL-6）和核转录因子-κB（NF-κB）活性检测，分析肝组织病理学改变。通过上述指标的改变分析黄芩对ASP大鼠疾病进程的影响。结果ASP组AMY、ALT、IL-6和NF-κB活性明显高于其他组，肝细胞变性，肝小叶中央静脉出血明显。Bai前后ASP组上述指标仅高于正常组，肝脏组织病变程度最轻。Bai前ASP组与抗生素组的治疗效果和病情发展变化程度相近；24 h时，Bai前ASP组和抗生素组的治疗效果和病情发展优于Bai后ASP组，但发病48 h时不及Bai后ASP组。结论黄芩对ASP大鼠肝损伤有预防和治疗作用，可以有效减轻肝、胰组织损伤程度。本研究所用剂量（ASP前预防性给3 g黄芩/100g体重；ASP后给予5 g黄芩/100 g体重）对ASP大鼠肝损伤有治疗作用。

关键词：急性重症胰腺炎；黄芩；预防及治疗作用

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急性重症胰腺炎（acute severe pancreatitis，ASP）指急性胰腺炎的严重状态，伴胰腺外的一个或多个器官功能衰竭，病死率可达50％[1]。目前，世界各国对急性重症胰腺炎的诊疗标准不一致，且单纯西医治疗效果不理想。近几十年来，根据中国传统医学衍生的中西医结合疗法取得可喜成绩，并形成一定规范[2]。大柴胡汤、大陷胸汤、清胰汤、大承气汤等疗效明确。黄芩（Baicaline，Bai）是大柴胡汤和清胰汤中的主要成分，对急性重症胰腺炎的病情进展有重要影响。有研究表明，黄芩的主要成分之一黄芩苷可以下调ASP大鼠胰腺血管内皮生长因子、核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）以及炎症细胞因子，对胰腺和肝脏组织有保护作用[3-4]。本研究采用中药黄芩对ASP大鼠进行预防及实验性治疗，根据血淀粉酶（Amylase，AMY）、谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT）、白细胞介素-6 （Interleukin-6，IL-6）和NF-кB指标的变化，以及肝组织病理表现，分析黄芩对大鼠ASP的预防及治疗作用。

1　材料与方法

1.1一般资料

清洁级Sprague Dawley大鼠36只，10周龄，体重（247.67±0.67）g，选自佳木斯大学实验动物中心。实验前进行适应性喂养2周，给予标准鼠粮（长春亿斯实验动物技术有限责任公司）、淡水、少量坚果和水果。

1.2仪器与试剂

AMY、ALT及IL-6试剂盒（上海依科赛生物公司），乙二醇乙醚溶液、10％福尔马林溶液、1％戊巴比妥钠注射液、5％牛磺胆酸钠购自上海埃比化学试剂有限公司，NF-κB、β-肌动蛋白引物购自北京化工厂，黄芩配方颗粒（华润三九医药股份有限公司，批号：140902W），注射液头孢哌酮（上海新先锋药业有限公司，批号：H31020687）。使用时将黄芩配方颗粒和注射液头孢哌酮溶于蒸馏水制成溶液。

1.3动物模型

选择Sprague Dawley大鼠进行体重测量并记录其舌苔、毛色。高脂饮食饲养2周后制作ASP模型。大鼠经乙醚吸入性麻醉，固定于实验台，注射1％戊巴比妥钠（0.2～0.3 ml/100 g）腹腔麻醉，3～5 min后清洁腹部，沿腹正中线开腹，观察大网膜有无出血或损伤，观察肝脏和胰腺组织颜色，寻找胆总管。分组如下：①正常组6只：轻缓翻动胰腺组织，生理盐水冲洗，关腹；②急性重症胰腺炎组（ASP组）6只：逆行经胰胆管注射5％牛磺胆酸钠0.10～0.15 ml/100 g，无菌纱布覆盖，约2 min后观察胰腺是否有充血、出血或坏死，成功后关腹；治疗组：③制模前给黄芩组（Bai前ASP组）6只：制模前1周喂养时给予大鼠黄芩溶液3 g/100 g体重，制模过程同ASP组；④制模后给黄芩组（Bai后ASP组）6只：制模后2 h给予ASP大鼠黄芩溶液5 g/100 g体重；⑤制模前后均给予黄芩组（Bai前后ASP组）6只：前后黄芩量同Bai前和后ASP组。⑥抗生素组（抗生素ASP组）：制模2 h后给予ASP大鼠头孢哌酮0.4 g/100 g体重。

1.4检测方法

1.4.1血AMY、ALT及IL-6测定每组大鼠随机分成两组，分别在术后24和48 h采门静脉血，用生化分析仪检测血AMY和ALT，并选肝左叶组织制成匀浆，应用酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测IL-6。

1.4.2肝组织病理和NF-κB活性测定术后24 和48 h采血，每只ASP大鼠取肝组织3～4块（左叶、右叶及肝中部血运较丰富处），放入10％福尔马林溶液中固定≥6 h，组织块修剪，放入组织包埋盒，固定、石蜡包埋后切片。切片后各组随机选1片进行苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，100倍视野光镜下观察组织的损伤。其余切片浸入0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH=7.4）浸泡、修复抗原。先后行一抗（兔抗大鼠）和二抗（山羊抗兔IgG）处理，滴加链素抗生物素-过氧化物酶溶液和链霉亲和素-生物素复合物（strept avidin-biotin complex，SABC）溶液，二氨基苯胺显色，轻度复染后脱水、透明化、封片。以细胞核或细胞浆出现褐黄色细颗粒状着色为阳性细胞。400倍显微镜下，每张切片随机选10个视野，计算阳性颗粒表达率。

1.5统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析，计量资料用（±s）表示，各组数据经方差齐性检验后，进行q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1一般情况

正常组、ASP组和各治疗组在实验过程中无意外死亡。实验结束时，正常组大鼠对外界刺激反应较强烈，毛色光泽度较好，可饮水、进食。ASP组大鼠精神状态差、反应迟钝、多嗜睡、毛色光泽度差，制模后到实验结束未见饮水及进食。各治疗组大鼠对外界刺激有反应，饮水及进食情况一般，个别大鼠有嗜睡及未饮水和进食现象。

2.2各组大鼠血AMY、ALT、IL-6和NF-κB活性比较

24 h时血AMY、IL-6、ALT和NF-κB活性的比较结果如下：ASP组>Bai后ASP组>Bai前ASP组和抗生素ASP组>Bai前后ASP>正常组。Bai前ASP组与抗生素ASP组各指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1　各组术后24和48 h的血AMY、ALT、IL-6和NF-κB活性比较（±s）

表1　各组术后24和48 h的血AMY、ALT、IL-6和NF-κB活性比较（±s）

组别　　术后24 h术后48 h AMY/（u/L）　IL-6/（pg/ml）　ALT/（u/L）　AMY/（u/L）　IL-6/（pg/ml）　ALT/（u/L）　NF-κB/活性正常组　532.17±2.32　293.43±2.84　63.50±3.83　19.50±1.38　534.50±2.88　285.67±2.66　66.33±2.66　20.33±1.63 ASP组　1017.50±4.18　463.33±4.72　187.17±6.24　40.83±1.94　1118.33±4.55　505.83±5.27　266.67±3.27　52.83±1.72 Bai前ASP组　881.67±2.42　387.83±2.32　149.67±3.32　31.17±1.72　933.17±2.71　402.67±3.93　222.50±3.45　36.33±2.16 Bai后ASP组　940.17±4.54　426.33±5.28　175.00±5.62　36.67±1.03　848.17±2.32　370.50±6.53　187.67±1.37　34.50±2.35 Bai前后ASP组　710.50±5.54　318.00±2.83　107.67±2.94　24.50±1.05　704.50±1.87　313.00±2.83　111.50±6.09　26.83±1.17抗生素ASP组　878.50±4.97　387.00±4.04　150.17±4.22　31.83±2.04　934.50±2.07　404.33±3.50　225.50±3.94　37.17±1.94 NF-κB活性

48 h时血AMY、IL-6和ALT的比较结果为：ASP组>Bai前ASP组和抗生素ASP组>Bai后ASP组>Bai前后ASP组>正常组。Bai前ASP组与抗生素ASP组各指标比较，差异无统计学意义（P> 0.05）。

48 h时NF-κB活性的比较结果如下：ASP组> Bai前、后ASP组和抗生素ASP组>Bai前后ASP 组>正常组。Bai前ASP组、抗生素ASP组与Bai后ASP组各指标比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

由此可见，24和48 h时Bai前后ASP组各指标都仅高于正常组，而低于其他治疗组，说明前后均给予黄芩的治疗效果最好。预先应用黄芩的Bai前ASP组与抗生素ASP组在各时段比较，差异无统计学意义，说明预先给予黄芩治疗与疾病发生后应用抗生素的治疗效果相近。24 h时Bai后ASP组的血AMY、IL-6和ALT高于Bai前ASP组和抗生素ASP组，48 h时又低于上述2组，说明应用黄芩治疗后肝、胰组织损伤明显减轻，随着时间延续，其效果将优于该两组。48h时Bai前、后组和抗生素组的NF-κB活性比较，差异无统计学意义，说明在此阶段，黄芩对NF-κB活性的调控幅度小于对IL-6、AMY和ALT的影响，可能与多因素参与病情进展，导致黄芩的治疗受多方面的影响有关。见表1。

表2　各组24 h与48 h检测指标比较的P值

2.324和48 h各组检测指标比较

ASP组、Bai前ASP组及抗生素ASP组检测指标随时间延长呈上升趋势，Bai后ASP组呈下降趋势，说明预先应用黄芩治疗与急性重症胰腺炎发生后立即应用抗生素效果一致，相比ASP组，可以减轻组织损伤，但不能有效缓解病情进展。而发病后立即应用黄芩，本组检测指标呈下降趋势，但24 h时Bai 后ASP组各检测指标仅低于ASP组而高于其他组（见表1），说明该组早期的肝脏和胰腺组织损伤较重。应用黄芩后指标下降，说明黄芩治疗急性重症胰腺炎效果显著。24 h进展到48 h时，Bai前后ASP组与正常组各检测指标趋向一致，且前后数值比较差异无统计学意义，说明疾病发生前后应用黄芩治疗，可以使急性重症胰腺炎的病情进展减缓，且波动不大，有效减轻肝、胰组织损伤。其机制可能与早期抑制NF-κB活性和IL-6表达有关。见表2。

图1　24 h各组肝组织病理表现（HE×100）

图2　48 h各组肝组织病理表现（HE×100）

2.4各组不同时间肝组织病理表现

肝组织病理切片显示，正常组肝小叶结构规则，肝细胞呈条索状分布。24和48 h时ASP组变性、坏死、出血明显。24 h时Bai前、后组和抗生素组的肝组织变性细胞较多，可见出血，Bai前ASP组略轻，但3组出血坏死程度较ASP组轻，比Bai前后ASP组严重。Bai前后ASP组较正常组出血严重，正常组48h时病理表现与24 h类似，但Bai前后ASP组出血表现有所缓解。Bai前后ASP组病理切片显示，肝组织损伤最低，提示ASP造模前后均给予黄芩的治疗效果优于其他组。见图1、2。

3　讨论

ASP是常见内科急重症，ASP合并的肝、肾损伤可以使死亡率由30～40％迅速上升为90％[5-7]。该病合并或伴随肝损伤的治疗效果对ASP患者的病情恢复有重要意义，包括免疫调节疗法、抗分泌、抗炎、蛋白抑制等药物疗法仍是目前临床主要的治疗方法，但关于针对细胞因子的免疫性因素的治疗方法尚在探讨[8]。

本研究发现，应用黄芩可以下调ASP患者的NF-κB活性和IL-6的水平，并使血AMY和ALT下降，促使病情改善。24和48 h时Bai前后ASP组的血AMY、IL-6、ALT和NF-κB活性仅高于正常组，而低于其他各组，病理表现肝组织损伤也较轻，提示在ASP发生前后应用黄芩的效果最佳。ASP在祖国传统医学中属湿热症范畴，本研究中ASP大鼠处于结胸里实期，治疗方案以通里攻下、活血化瘀、顺气解郁等为主，大柴胡汤合大陷胸汤疗效肯定[2，9]。黄芩是大柴胡汤中的主要成分，性味苦寒，入心肺胆大肠经，属清热药，可以清热去湿、泻火解毒、凉血止血功能。已有研究证实，黄芩可以对抗内毒素的活性，减轻组织损伤[10]。黄芩的主要有效成分黄芩素可以降低模型小鼠肝脏指数及血清ALT、谷草转氨酶的活性，提高小鼠超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的活性，起到一定程度的保护作用[11]。本研究提示，在ASP发生前后都应用黄芩可以减轻肝、胰组织损伤。其机制可能是通过抑制NF-κB活性，降低炎症细胞因子IL-6的含量，从而进一步降低血AMY和ALT的浓度，起保护胰腺和肝脏功能的作用。本研究中所应用的治疗剂量（ASP前预防性给3 g黄芩/100 g体重；ASP后给予5 g黄芩/100 g体重）较为适宜。建议考虑对高血脂、高脂肪饮食、高蛋白饮食、肥胖、嗜酒等危险人群给予预防性应用黄芩治疗，但其应用剂量要因人而异。

24和48h时，各治疗组的检测指标低于ASP组，说明无论是预先应用黄芩，还是ASP发生后应用黄芩或抗生素都有一定程度的治疗或者保护作用，对肝、胰组织损伤有一定的缓解。但以下3组检测指标的变化又有所不同：①Bai前ASP组（3 g黄芩/100 g体重）与抗生素组治疗效果类似，24 h时治疗效果好于Bai后ASP组（5 g黄芩/100 g体重）；②48 h时Bai前ASP组和抗生素组的血AMY、ALT和IL-6高于Bai后ASP组，肝胰损伤较Bai后ASP组严重，说明随着时间推移，Bai后ASP组的治疗效果逐渐提高；③48 h时Bai前、后组与抗生素ASP组的NF-κB活性比较，差异无统计学意义，说明该阶段黄芩对NF-κB活性的抑制作用低于对IL-6、AMY 及ALT的影响。笔者分析认为，给药时间及剂量的不同导致黄芩对NF-κB活性、IL-6的调控不同，继而影响AMY和ALT。因黄芩还可能通过抑制胰腺聚二磷酸-核糖聚合酶活性[12]，下调胰腺组织血管内皮生长因子的表达[13]保护胰腺组织，降低AMY；又可以通过抗氧化[11]、预防内毒素血症[14]、降低肝组织线粒体SDH活性减少三磷酸腺苷生成，抑制能量代谢亢进[15]，起到保护肝脏组织、降低ALT的作用，所以黄芩其实是在多层面、多角度参与ASP肝损伤的预防和治疗作用。

综上所述，黄芩对ASP肝损伤具有预防和治疗作用。本研究就应用剂量进行探讨并得出明确结论。由于实验动物比较标准化、生长环境单一、外界影响因素较小，而临床患者地域、习俗、性别、年龄、职业等不同，ASP患者的临床表现和病情也千差万别，在临床进行推广时要充分考虑患者的个体差异。

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（申海菊编辑）

Protective and treatment effects of Scutellaria baicalensis on injured hepatic tissue of rats with acute severe pancreatitis*

Qi Jin, Tian-rui Cai, Shuo Huang, Qi-yong He, Yu-hong Sun
(The First Affiliated Hospital, Jiamusi University, Jiamusi, Heilongjiang 154002, P.R.China)

Abstract:Objective To study the preventive and treatment effectsof Scutellaria baicalensis on injured hepatic tissue of rats with acute severe pancreatitis (ASP).Methods Thirty-six Sprague Dawley rats were randomly divided into normal group (normal), ASP group, Bai-pre-ASP group (using Scutellaria baicalensis before acute severe pancreatitis model), Bai-post-ASP(using Scutellaria baicalensis after acute severe pancreatitis model), Bai-pre post-ASP group (using Scutellaria baicalensis before and after acute severe pancreatitis model), and Cef-ASP group (using Cefoperazone after acute severe pancreatitis model).The blood AMY, ALT, IL-6 and nuclear factor (NF)-кB were detected 24 and 48 h after the drugs were given to the rats.The hepatic tissues were also analyzed.The effects of Scutellaria baicalensis on the procedure of acute severe pancreatitis in rats were investigated.Results The activity of AMY, ALT, IL-6 and NF-кB in the ASP group was obviously higher than other groups.Degeneration of hepatic cells, hemorrhage of central veins of hepatic lobules were apparent.The above indexes of the Bai-pre post-ASP group were higher than those of the normal group, but lower than those of other treatment groups.The treatment effect in the Bai-pre-ASP group was similar to that of the Cef-ASP group, and they were better than that of the Bai-post-ASP group in 24 h.However, they were worse than those of the Bai-post-ASP group in 48 h.Conclusions Scutellaria baicalensis has the effects of prevention and treatment on the liver injure of the rats with acute severe pancreatitis.Our research showedbook=19,ebook=24that the usage of Scutellaria baicalensis 3 g per 100 g weight before ASP and 5 g per 100 g weight after ASP is appropriate for treatment of liver injury in ASP rats.

Keywords:acute severe pancreatitis; Scutellaria baicalensis; prevention and treatment

通信作者]黄朔，E-mail：695112039@qq.com

*基金项目：黑龙江省教育厅面上项目（No：12531676）

收稿日期：2015-07-27

文章编号：1005-8982（2016）01-0018-06

中图分类号：R657.51；R285.5

文献标识码：A