赵继明，彭健（中南大学湘雅医院，湖南长沙410008）



Micro RNA-132对结肠癌细胞生物学功能的作用

赵继明，彭健
（中南大学湘雅医院，湖南长沙410008）

摘要：目的探讨microRNA-132（miR-132）对结肠癌细胞系LOVO生物学功能的作用。方法通过体外转染miR-132 mimic的方式进行获得性功能实验。以细胞计数检测（CCK-8）、平板克隆形成、流式细胞凋亡检测以及划痕实验分析miR-132过表达对LOVO细胞增殖与侵袭的影响。结果LOVO细胞中，外源性过表达miR-132能够抑制其生长，且抑制率呈时间、浓度依赖性，50 nmol/L miR-132 mimic处理72 h后，抑制率达30％。流式细胞凋亡检测发现miR-132过表达诱导细胞凋亡。miR-132过表达可以抑制LOVO细胞体内的外克隆形成能力。体外平板克隆形成实验显示，miR-132过表达使LOVO细胞克隆形成率从21％降至7％。划痕修复实验结果显示，高表达miR-132各组细胞的迁移能力降低。结论miR-132过表达能显著抑制结肠癌细胞LOVO发生细胞凋亡及增殖，还能削弱结肠癌细胞LOVO的克隆形成能力。

关键词：microRNA-132；凋亡；增殖；迁移；克隆形成

MicroRNA-132（miR-132）是高度保守miRNA，其通过转录因子cAMP效应元件结合蛋白，从人类17号染色体上基因间隙区域转录而来[1]。大多数研究表明，miR-132的调节作用和生物学功能来源于神经元[2]。miR-132在炎症、细胞转化和肿瘤生成等病理过程中的作用也被学者们研究证实[3]。有研究指出，不同类型的人类癌症中miR-132表达上调或下调[4]。但是，关于miR-132对结肠癌细胞生物学行为作用的系统研究较为少见。

由于不同结肠癌细胞内源性miR-132表达水平可能存在差异，为排除内源性miR-132对实验的干扰，本研究采用荧光实时定量逆转录酶联免疫反应检测6株结肠癌细胞株（HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO及SW480）和HCo EpiC正常结肠细胞株中miR-132的表达。选取内源性miR-132表达水平最低的细胞株作为研究对象，将miR-132mimics转染至该细胞株，建立miR-132过表达结肠癌细胞模型。检测miR-132过表达对结肠癌细胞增殖、凋亡、细胞周期及迁移能力等生物学行为的影响，以期进一步了解miR-132在结肠癌发生、发展中的作用。

1　材料与方法

1.1实时定量聚合酶链反应

实时定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测结肠癌细胞株和正常结肠黏膜上皮细胞株中miR-132的表达。人结肠上皮细胞HCo EpiC、人结肠癌细胞系HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO及SW480购自中国科学院上海细胞库，常规培养于含10％小牛血清的无血清细胞冷冻保存（dulbecco modified eagle medium，DMEM）高糖培基中。依照RNA提取试剂盒说明书提取HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO、SW480及HCoEpiC细胞中总RNA。紫外分光光度仪测定总RNA浓度与纯度，A260/A280值为1.8～2.0，1％琼脂糖凝获电泳检测质量。分别取HCT116、HCT8、HT29、LS174T、LOVO、SW480及HCo EpiC总RNA各1μg，逆转录酶混合液lμl，5×逆转录酶缓冲液4μl，加无RNA酶水至反应体积为20μl。37℃温浴60 min，95℃、5 min，终止反应。2×PCR预混液25μl，10×通用引物5μl，10×特异引物Assay 5μl（hsa-miR-132引物序列代号为MS00004276，U6引物穿列代号为MS00007497，以U6为内参，德国Qiagen公司提供），cDNA模板2μl，加光RNA酶水定容至总反应体积50μl。反应条件：95℃预变性15 min，94℃变性15 s，55℃退火30 s，70℃延伸34 s，共8个循环。相同条件下实验重复3次。

1.2实验分组

由于miR-132在结肠癌LOVO细胞中的表达最低，因此本研究后续以LOVO细胞为研究对象来探讨miR-132对结肠癌细胞生物学行为的作用。miR-132 mimics购自美国Ambion公司。转染时细胞分为4组：①空白组，不作任何处理，继续常规培养；②阴性对照组，转染时加入无关序列Scramble mimics+脂质体2000；③实验组，转染时加入miR-132 mimics+脂质体2000；④羧基荧光素（Carboxyfluorescein，FAM）对照组，转染时加入FAM-mimics control，该组用来检测转染效率，不再进行后续实验。

1.3细胞克隆形成实验

将空白组、阴性对照组及实验组细胞培养至指数生长期，细胞悬液浓度调整为1×106个/ml，接种至双琼脂平板，待上层琼脂凝固后，常规培养2周。将细胞培养皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数，计算形成率。克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100％。

1.4细胞活力检测

空白组、阴性对照组及实验组细胞培养至指数生长期，以1 000个/孔的密度接种于96孔细胞培养板，设6个平行孔，每孔体积为0.2 ml。分别于1、2、3和4 d各取一块96孔板培养板，超净台内弃去原培养液，加入按9∶1混合的培养液与细胞计数检测（cell counting kit-8，CCK-8）反应液，96孔板继续培养箱内孵育1 h后取出，轻轻震荡10 min，用酶标仪于450 nm处检测各孔吸光度值（optical delnsity，OD值），并按以下公式计算相对细胞增殖率：相对细胞增殖率（％）=（实验孔平均OD值-空白调零平均OD值）/（对照孔平均OD值-空白调零平均OD值）×100％。实验重复3次。

1.5流式细胞仪检测

流式细胞仪检测转染miR-132 mimics对结肠癌LOVO细胞凋亡的影响。各组膜联蛋白V-异硫氰酸酯（annexin V-fluoresceine isothiocyanate，Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染，同时设置未染色空白对照管、单染Annexin VFTIC管及单染PI管。将环氧树脂（epoxy epoxide，EP）管置于冰上，避光条件下室温静置10 min，加入400μl 1×Binding Buffer，轻轻混匀，并在30 min内进行检测。以未染色空白细胞为基准调零机器，以Annexin V-FITC单染管和PI单染管做为基准参照，测定每个上样EP管的数据。采用Cell Quest 3.0软件进行参数获取和资料分析，计算凋亡细胞百分比。

1.6划痕修复实验

划痕修复实验检测miR-132 mimics对结肠癌LOVO细胞迁移能力的影响。取对数生长期的各组LOVO细胞，消化、计数，以5×105个/ml的密度接种于24孔板中，每孔500μl，培养4 h。待细胞贴壁后用小枪头沿着每孔偏中线两侧划痕，划痕应较直且宽度一致，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffersaline，PBS）清洗1遍，确保清洗掉痕线上散在的细胞。每组设3个平行孔，加入含2％胎牛血清的DMEM培养液再放入培养箱内培养24、48和72 h，分别于每个时间点观察细胞向中间的迁移情况，并在显微镜下拍照记录。注意每次拍照的位置应固定，且每次拍照前用PBS洗2遍以去除漂浮的死细胞。计算闭合率以反映细胞的迁移能力，闭合率（％）=（迁移距离/划痕距离）×100％。

1.7统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间样本比较用Student’s t检验分析，P<0.05为差异统计学意义。

2　结果

2.1正常结肠细胞和结肠癌细胞中miR-132的表达

miR-132在结肠癌细胞中的表达与其在结肠癌组织中的表达基本一致，正常结肠细胞HCo EpiC中miR-132呈高表达，而6种结肠癌细胞株中miR-132表达被不同程度地抑制（见图1）。其中LOVO细胞中内源性miR-132表达水平最低。

图1　正常结肠细胞和结肠癌细胞中miR-132的表达（P=0.014）。见图3。

2.2miR-132对LOVO细胞克隆形成的作用

用miR-132 imimics（实验组）转染LOVO细胞，使其过表达miR-132，与阴性对照组（Scramble mimics组）和空白组比较，实验组克隆数明显下降，差异有统计学意义（P=0.032），而阴性对照组和空白组的克隆数比较差异无统计学意义。见图2。

图2　3组克隆数比较

2.3MiR-132对LOVO细胞增殖能力的作用

本实验采用CCK-8法绘制LOVO细胞系生长曲线，结果显示，LOVO细胞转染miR-132 mimics 72 h后，细胞增殖能力逐渐下降。实验组细胞72、96 和120 h增殖能力明显低于阴性对照组和空白组

图3　miR-132 mimics对LOVO细胞生长能力的抑制作用

2.4miR-132对LOVO细胞凋亡的作用

流式细胞仪检测细胞凋亡，结果显示，空白组、阴性对照组及实验组的凋亡率分别为（2.94±0.81）％、（3.02±1.12）％和（15.04±1.52）％。空白组与阴性对照组比较，差异无统计学意义（P=0.684）；实验组和空白组比较，差异有统计学意义（P=0.003）。提示miR-132可促进LOVO细胞凋亡。见图4。

2.5miR-132对结肠癌LOVO细胞迁移能力的作用

分别于24、48和72 h观察各组细胞的划痕修复。实验组LOVO细胞迁移能力被抑制，48 h后各组迁移能力明显受到抑制，差异有统计学意义（P= 0.037）。见附表。

图4　流式细胞术检测3组细胞的凋亡率

附表　3组细胞在不同时间的闭合率比较（％，±s）

附表　3组细胞在不同时间的闭合率比较（％，±s）

组别　24 h　48 h　72 h空白组　15.21±3.56　27.11±2.52　67.79±3.97阴性对照组　15.41±2.72　25.42±3.18　68.34±5.62实验组　11.37±1.44　19.52±3.26　31.34±4.62

3　讨论

miRNA是包含19～25个碱基的小分子非编码RNAs，能够通过与靶基因mRNAs的3’-非翻译区（3’-untranslated regions，3’-UTRs）反应，反向调控靶基因表达。研究证实，miR-132具有调控多巴胺神经元分化，激活内皮细胞，发挥病理血管生成的作用[5]。还有研究表明，miR-132参与胰腺癌的发展过程[6]。

近年来，关于miR-132对肿瘤细胞生物学行为的作用的研究成果层出不穷，但是这些结果多有矛盾之处。You等[7]研究表明，miR-132在非小细胞肺癌和非小细胞肺癌组织标本中显著下降，且恢复非小细胞肺癌细胞株中的表达，能够抑制miR-132迁移和侵袭。Zhang[8]等研究发现，miR-132能够抑制乳腺癌细胞的增殖、分化和转移等。Luo等[9]研究发现，miR-132/212簇能显著抑制肺癌细胞株H1299在裸鼠皮下的成瘤能力。而Park等[10]在胰腺癌中的研究发现，miR-132在胰腺癌组织中表达增加，抑制胰腺癌细胞株中miR-132表达导致胰腺癌细胞凋亡加快，侵袭和迁移能力显著下降。本研究结果表明，恢复结肠癌细胞中MiR-132的表达，能显著抑制结肠癌细胞恶性表型。MiR-132在不同肿瘤中发挥相反作用的原因目前仍不清楚，结合以往研究结果，本实验推测其主要原因为：①肿瘤的异质性。不同肿瘤组织间的异质性，以及同类肿瘤组织中的异质性都可能导致miR-132作用的差异；②肿瘤来源不同，导致miR-132的作用也不尽相同。有的肿瘤源自内皮细胞，有的源自上皮细胞，而结肠癌细胞主要源自结肠星状细胞；③不同肿瘤组织中靶基因表达丰度不同也导致miR-132作用差异。众所周知，miRNA主要通过靶基因发挥作用，而且一种miRNA可能存在多种靶基因，而不同肿瘤组织中靶基因表达丰度不同，导致miR-132作用的靶基因也不一致，从而引起miR-132表达作用不同。

本研究发现，结肠癌LOVO细胞稳定过表达miR-132 mimics后，细胞增殖能力、体外细胞克隆形成率、抗凋亡能力、体内致瘤能力明显下降，结果提示，结肠癌细胞的恶性表型与miR-132表达缺失有关。miR-132是结肠癌治疗的潜在有效靶点。国内学者李书军等[11]也做过类似的研究工作，探讨miR-132对食管癌KYSE150细胞肿瘤调节因子FOXA1及mRNA表达的调节作用对食管癌KYSE150细胞增殖的影响，结果表明，过表达的miR-132能抑制KYSE150食管癌细胞增殖，该抑制作用至少部分与FOXA1基因的低表达有关。管娣等[12]试图识别和发现肿瘤转移相关miRNA，以期能够作为治疗靶点高效抑制肿瘤转移，其为验证miR-132与肿瘤迁移的相关性，将miR-132转染入高迁移乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞中，检测细胞迁移率的变化，结果发现miR-132能够抑制MDA-MB-231细胞的迁移。管娣等[12]为进一步揭示miR-132抑制细胞迁移的可能机制，通过生物信息学手段寻找并鉴定3种可能与肿瘤转移相关的miR-132的靶基因，其分别是STIP1同源性和含U框蛋白1（STIP1 homologous and U box containing protein1，STUB 1）、GTP酶激活蛋白-Src同源结构域3-结合蛋白1[GTPase activating protein-（Src homology domain 3）-bindingprotein 1, G3BP1]、GTP酶激活蛋白-Src同源结构域3-结合蛋白2[GTPase activating protein-（Src-homology domain 3)-binding protein 2, G3BP2]。管娣等[12]分别比较MCF7与MDA-MB-231细胞，以及转染miR-132和阴性对照组MDA-MB-231细胞3种基因的表达差异，结果发现，G3BP1、G3BP2可能参与miR-132对肿瘤转移的调控，与本研究结果类似。

总之，结合以往和本研究结果，miR-132有望成为结肠癌肿瘤基因治疗的潜在高效靶点。

参考文献：

[1] Kano M, Seki N, Kikkawa N, et al.MiR-145, miR-133a and miR-132b: tumor suppressive miRNAs target FSCN1in esophageal squamous cell carcinoma[J].Int J Cancer, 2010, 127(12): 2804-2814.

[2] Luikart BW, BensenN AL, Washburn EK, et al.MiR-132 mediates the integration of newborn neurons into the adult dentate gyrus[J].PLoS One, 2011, 6(5): DOI: 10.1371/journal.pone.0019077.

[3] Yang D, Li T, Wang Y, et al.MiR-132 regulates the differentiation of dopamine neurons by directly targeting Nurr1 expression[J].J Cell Sci, 2012, 125(7): 1673-1682.

[4] Hwang JY, Kaneko N, Noh KM, et al.The gene silencing transcription factor REST represses miR-132 expression in hippocampal neurons destined to die[J].J Mol Biol, 2014, 426(9): 3454-3466.

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[6] Formosa A, Lena AM, Markert EK, et al.DNA methylation silences miR-132 in prostate cancer[J].Oncogene, 2013, 32 (1): 127-134.

[7] You J, Li Y, Fang N, et al.MiR-132 Suppresses the migration and invasion of lung cancer cells via targeting the EMT regulator ZEB2[J].PLos One, 2014, 9(3): DOI: 10.1371/journal.pone.0091827.

[8] Zhang ZG, Chen WX, Wu YH, et al.MiR-132 prohibits proliferation, invasion, migration, and metastasis in breast cancer by targeting HN1[J].Biochem Biophys Res Commun, 2014, 454(4): 109-114.

[9] LuoO JD, Meng CC, Tang YT, et al.MiR-132/212 cluster inhibits the growth of lung cancer xenografts in nude mice[J].International Journal of Clinical and Experimental Medicine, 2014, 7(11): 4115-4122.

[10] Park JK, Henry JC, Jiang JM, et al.MiR-132 and miR-212 are increased in pancreatic cancer and target the retinoblastoma tumor suppressor[J].Biochem Biophys Res Commun, 2011, 406(4): 518-523.

[11]李书军,张秀金,侯俊峰,等.Hsa-miR-132通过靶向FOXA1基因影响食管癌细胞的增殖和侵袭[J].中国肿瘤生物治疗杂志,2011, 18: 485-489.

[12]管娣,刘春颖,陈晨等.MiR-132抑制肿瘤转移[J].生物化学与生物物理进展, 2013, 12(2): 159-164.

（童颖丹编辑）

Eeffect of miR-132 on biological characteristics of colon cancer cells

Ji-ming Zhao, Jian Peng
(Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan 410008, China)

Abstract:Objective To investigate the effect of miR-132 on biological characteristics of conlon cancer LOVO cell line.Methods Synthetic miR-132 mimics and miRNAs cramble were transfected into LOVO cells using Lipofectamine 2000.Transwell assay was used to assess the effect of miR-132 on LOVO cell invasion and metastasis.CCK-8 assay was used to assess the effect of miR-132 on LOVO cell proliferation.Flow cytometry was used to assess the effect of miR-132 on LOVO apoptosis.Results Over-expression of miR-132 induced LOVO cell apoptosis, and subsequently inhibited LOVO cell growth and colony formation.Notably, 50 nmol/L miR-132 mimic demonstrated a potent inhibitory effect at 72 h after transfection and reduced cell viability by 30％.The colony formation ability was impared after miR-132 mimic treatment with a 14％ drop of in vitro colony formation rate.Also, miR-132 inhibited the LOVO cell migration.Conclusions miR-132 could suppress colon cancer cell growth through induction of cell apoptosis.

Keywords:miR-132; apoptosis; proliferation; migration; colony formation

[通信作者]彭健，E-mail：pengjian1698@aliyun.com

收稿日期：2015-10-16

文章编号：1005-8982（2016）01-0030-05

中图分类号：R735.35

文献标识码：A