李利华，卢滨，吴红科，张浩，姚菲菲（郑州人民医院呼吸科，河南郑州450000）



白藜芦醇抑制Sonic hedgehog信号并减轻大鼠肺纤维化的研究

李利华，卢滨，吴红科，张浩，姚菲菲
（郑州人民医院呼吸科，河南郑州450000）

摘要：目的研究白藜芦醇对博莱霉素诱导大鼠肺纤维化的影响。方法完全随机分组法将40只SD雄性大鼠分为4组：对照组、模型组、25μmol白藜芦醇组和50μmol白藜芦醇组。模型组大鼠气管内滴注博莱霉素，25和50μmol白藜芦醇组大鼠气管内滴注博莱霉素后分别用25和50μmol白藜芦醇灌胃，对照组大鼠气管内滴注生理盐水。处理30 d后，观察各处理组大鼠肺组织病理变化并检测大鼠肺组织羟脯氨酸（HYP）和Ⅰ型胶原蛋白含量。分离各组大鼠肺成纤维细胞，并利用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）和Western blot检测细胞中SHH（Sonic hedgehog，SHH）、Smo、Gli-1 mRNA和蛋白的表达，同时检测细胞增殖和凋亡。结果模型组大鼠肺泡结构严重破坏并伴有胶原纤维沉淀，白藜芦醇处理可减轻纤维化病变。白藜芦醇可降低肺组织中博莱霉素诱导的HYP和Ⅰ型胶原蛋白含量。博莱霉素能显著上调成纤维细胞中SHH、Smo、Gli-1 mRNA和蛋白的表达，而白藜芦醇则可抑制SHH、Smo和Gli-1的表达。博莱霉素促进成纤维细胞增殖并减少凋亡，白藜芦醇抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。结论白藜芦醇可抑制博莱霉素诱导的SHH信号活化并减轻大鼠肺纤维化。

关键词：白藜芦醇；sonic hedgehog信号；肺纤维化；博莱霉素；成纤维细胞

肺间质纤维化是一种多诱因的慢性肺疾病[1]。肺间质纤维化病变过程中，肺泡上皮细胞和内皮细胞损伤，肺泡基底膜破坏，细胞外基质沉积并成纤维细胞聚集和增殖[2]。白藜芦醇是非黄酮类多酚化合物，广泛存在于葡萄、虎杖、花生、桑葚等植物中，有抗氧化、消炎、抗肿瘤、调节激素等作用[3]。近年来，多个实验证明白藜芦醇可对实验动物肺纤维化疾病进展产生影响[4-6]，但具体作用机制还不清楚。因此，本研究着眼于白藜芦醇对博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化的影响，分析白藜芦醇的作用机制，为肺纤维化的治疗提供实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物与主要试剂

40只4周龄雄性SD大鼠购自上海斯莱克实验动物公司，将实验动物饲养于12 h昼/夜循环照明、恒温、恒湿的清洁级环境中，自由饮食，饲养1周后备用。白藜芦醇、戊巴比妥钠、聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自美国Sigma公司，博莱霉素购自美国Invitrogen公司，羟脯氨酸（Hydroxyproline，HYP）检测试剂盒购自南京建成生物，Trizol试剂和Dy NAmo SYBR Green荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）试剂盒购自大连宝生生物有限公司，抗Ⅰ型胶原蛋白抗体、抗SHH（sonic hedgehog，SHH）抗体、抗Smo抗体、抗Gli-1抗体购自美国Santa Cruz Biotech公司，辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗购自英国Abcam公司，Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝公司，噻唑蓝[3-（4，5-dimethyl- 2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]试剂盒购自北京百浩生物公司，其余常见试剂为国产。

1.2动物分组处理

利用随机数字法将40只5周龄雄性SD大鼠随机分为4组：对照组、模型组、25μmol白藜芦醇组和50μmol白藜芦醇组，每组10只。模型组大鼠气管内注射4 mg/kg博莱霉素建立肺纤维化模型，25和50μmol白藜芦醇组大鼠气管注射博莱霉素后第2天分别用25和50μmol白藜芦醇灌胃，处理30 d。对照组和模型组利用生理盐水灌胃。模型组大鼠于博莱霉素滴注后死亡2只，对照组和50μmol白藜芦醇组灌胃第6天分别死亡1只大鼠，25μmol白藜芦醇组分别于博莱霉素滴注后及白藜芦醇灌胃第3天死亡1只大鼠。处理结束后，利用戊巴比妥钠深度麻醉处死大鼠，分离大鼠肺成纤维细胞备用。检测各组大鼠肺组织HYP和Ⅰ型胶原蛋白表达，制作病理切片，观察肺纤维化病变。

1.3肺成纤维细胞分离和培养

大鼠肺成纤维细胞的分离参考朱天琦等[7]的方法。将分离得到的成纤维细胞置于37℃、5％二氧化碳CO2培养箱，用含15％胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的H-DMEM培养液培养，隔天换液1次。细胞生长接近融合时，弃培养液，D-Hanks液轻洗3次，加入0.25％胰酶消化1min，用含15％FBS的H-DMEM培养液终止消化，吸管轻轻吹打细胞，收集细胞悬液，1 000 r/min离心2 min，弃上清液，用15％ FBS 的H-DMEM培养液，按1∶2接种传代培养。利用免疫细胞化学方法检测细胞中波形蛋白和CD31的表达，对原代肺成纤维细胞进行鉴定。

1.4MTT检测细胞增殖

分离肺成纤维细胞，将来源于对照组、模型组、25和50μmol白藜芦醇组大鼠的肺成纤维细胞，按3×103个/孔接种于96孔培养板。每孔细胞加入含15％FBS的H-DMEM培养液进行培养。细胞培养24、48、72和96 h后分别进行MTT实验检测。按实验分组，每孔加入20μl MTT（5 mg/ml）后培养4 h。去上清液，每孔加入150μl二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。混匀后用酶标仪（Instruments，美国Bio-tek公司）测定（测量波长为490 nm）。实验重复3次，取平均数作为实验结果。

1.5流式细胞术检测细胞凋亡

收集分离培养的大鼠肺成纤维细胞，分别对应对照组、模型组、25和50μmol白藜芦醇组。首先用PBS洗涤细胞，细胞计数后调整细胞密度为1×106/L，制成单细胞悬液，加入100μl结合缓冲液与FITCAnnexinⅤ（20μg/ml）10μl，室温避光放置30 min，加入5μl PI（50μg/ml），室内避光反应5 min，加入400μl结合缓冲液，上流式细胞仪检测。

1.6HYP含量测定

采用商业化HYP试剂盒检测各组大鼠肺组织中HYP含量。试剂盒主要原理是利用氧化HYP与4-（二甲氨基）苯甲醛（DMAB）的生色反应来测定HYP浓度，反应生成与样品中HYP含量成正比的比色（560 nm）产物。

实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）使用Trizol试剂提取大鼠肺组织总RNA，并逆转录成cDNA，并以该cDNA为模板扩增基因片段，所用引物见表1。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后染色、拍照。采用ABI 7500型实时荧光定量PCR仪和Dy NAmo SYBR Green qPCR试剂盒对目的基因表达进行测定。分别根据产生的Ct值从各自的标准曲线获得目的基因和β-actin基因的拷贝数。取3次的平均值，以目的基因的拷贝数除以β-actin的拷贝数作为靶基因的相对表达量。

表1　实时定量PCR引物序列

1.7Western blot检测

提取肺组织总蛋白，利用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶恒压电泳分离蛋白，随后转移蛋白至PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的Tris-HCl缓冲盐溶液+Tween（TBS+Tween，TBST）室温下水平摇床慢摇封闭1 h。利用抗Ⅰ型胶原蛋白抗体、抗SHH抗体、抗Smo抗体或抗Gli-1抗体4℃孵育过夜。隔天TBST漂洗3遍，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠二抗（1∶20 000），室温下水平摇床慢摇孵育1 h。选取β-actin作为蛋白表达内参。TBST漂洗3遍后进行增强化学发光法（enhanced chemiluminescence，ECL）显色，凝胶成像分析系统进行拍照分析。

1.8肺组织病理切片与Masson染色

将大鼠肺组织用4％甲醛固定，将固定好的样本按顺序置于脱水机中脱水。将过夜的肺组织取出，置于沾有少量蜡液的包埋盒中包埋。将蜡块固定于切片机上，切成4～6μm薄片。采用Masson三色染色法分析，切片常规脱蜡至水，置于Bouin液室温过夜或56℃中处理1 h，自来水冲洗至黄色消失后蒸馏水洗涤。Weigert铁苏木精染核10 min，盐酸乙醇分化，自来水冲洗10 min，蒸馏水洗涤。按照Ⅰ液染2 min，Ⅱ液染15 min，Ⅲ液染5 min的顺序进行处理；蒸馏水洗涤1 min后，1％冰乙酸溶液浸洗5 min，常规脱水透明，中性树胶封片。

1.9统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验和单因素方差分析，用LSD法进行多重比较，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1白藜芦醇抑制博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化

病理结果显示，对照组大鼠肺组织结构正常，肺泡结构完整。模型组大鼠肺组织肺泡壁增厚，肺泡结构破坏严重，可见大量胶原纤维沉淀以及成纤维细胞增生。白藜芦醇处理大鼠肺泡结构破坏相对较轻，同时可见少量胶原纤维沉淀和成纤维细胞增生，肺组织中性粒细胞浸润减少。见图1。

图1　各组大鼠肺组织病理切片观察（Masson染色×400）

2.2白藜芦醇降低模型大鼠肺组织HYP和Ⅰ型胶原蛋白的含量

与对照组比较，模型组大鼠肺组织HYP含量明显升高（P=0.002）。白藜芦醇可明显降低肺组织HYP含量，并具有剂量效应；25μmol白藜芦醇组HYP含量与对照组、模型组比较，差异有统计学意义（P=0.024和0.015）；50μmol白藜芦醇组HYP含量与模型组比较，差异有统计学意义（P=0.003）（见表2）。与对照组比较，博莱霉素诱导的大鼠肺组织中Ⅰ型胶原蛋白表达显著上调（P=0.001）；白藜芦醇则显著下调模型大鼠Ⅰ型胶原蛋白表达（25μmol白藜芦醇组P=0.032，50μmol白藜芦醇组P=0.011。见图2。

表2　各组大鼠肺组织HYP含量测定

图2　各组大鼠肺组织Ⅰ型胶原蛋白免疫印迹法定量分析

2.3白藜芦醇下调模型大鼠肺成纤维细胞SHH信号的表达

与对照组比较，模型组大鼠成纤维细胞中SHH、Smo和Gli-1 mRNA和蛋白表达水平显著上升（mRNA：PSHH=0.000，PSmo=0.000，PGli-1=0.000；蛋白：PSHH=0.000，PSmo=0.000，PGli-1=0.000）；白藜芦醇显著降低博莱霉素诱导的SHH、Smo和Gli-1 mRNA和蛋白表达（25μmol白藜芦醇组mRNA：PSHH=0.000， PSmo=0.022，PGli-1=0.000；蛋白：PSHH==0.002，PSmo=0.024，PGli-1=0.021；50μmol白藜芦醇组mRNA：PSHH= 0.000，PSmo=0.013，PGli-1=0.000；蛋白：PSHH=0.000，PSmo= 0.018，PGli-1=0.000）。见图3、4。

2.4白藜芦醇降低成纤维细胞的增殖

与对照组比较，博莱霉素能显著提高大鼠肺成纤维细胞增殖速率（P=0.033）；与模型组比较，白藜芦醇能明显降低成纤维细胞的增殖（25μmol白藜芦醇组P=0.027，50μmol白藜芦醇组P=0.024）。见图5。

图3　各组大鼠肺成纤维细胞SHH、Smo和Gli-1 mRNA的荧光定量PCR

图4　各组大鼠肺成纤维细胞SHH、Smo和Gli-1蛋白的荧光定量PCR

图5　MTT法测定各组大鼠肺成纤维细胞体外增殖

2.5白藜芦醇促进成纤维细胞凋亡

流式细胞术结果显示，博莱霉素能降低成纤维细胞凋亡率（P=0.041），而白藜芦醇则能显著促进成纤维细胞的凋亡（25μmol白藜芦醇组P=0.036，50μmol白藜芦醇组P=0.021）。见图6。

图6　流式细胞术测定各组大鼠肺成纤维细胞凋亡比率

3　讨论

作为一种进行性肺疾病，肺纤维化患者在诊断后5年病死率达65％[8]，目前还没有公认的有效治疗方法，主要采用抗炎、抗纤维化、抗凝血及肺移植等治疗措施，疗效各有优劣[9]。因此，迫切需要探索新的有效而副作用低的治疗方法。白藜芦醇是一种从植物中提取的天然药物，在抗肿瘤、治疗心血管疾病、抗氧化等方面疗效显著，毒性低，便于长期服药[10]。白藜芦醇在实验性肺纤维化模型中的作用越来越受到关注，有望开发为治疗人体肺纤维化的临床用药。

本研究通过向大鼠气管滴注博莱霉素建立肺间质纤维化模型，病理、组织结果发现，模型大鼠较对照组肺泡结构受损严重，有明显的胶原蛋白沉积，成纤维细胞大量增生。另建的立白藜芦醇处理组，结果发现，白藜芦醇能够保护肺泡结构，减少组织损伤，并减轻模型大鼠肺间质纤维化和炎症反应，表明白藜芦醇有拮抗博莱霉素的作用，能减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化。

本研究中，肺纤维化模型大鼠肺组织HYP含量和Ⅰ型胶原蛋白表达水平明显增高。白藜芦醇处理后，模型大鼠肺组织中HYP含量减少，Ⅰ型胶原蛋白水平降低。多种信号途径包括STAT、酪氨酸蛋白激酶、MAPK、TGF-β参与肺纤维化进展[11]。SHH途径参与肺脏在胚胎期的发育[12]，并且在成体胚胎干细胞的维持中具有重要作用[13]。Teglund等[14]的研究也发现其参与多种癌症的发生。最近多个研究发现，SHH参与肺纤维化病变[15]。Hu等[16]证明SHH在体外可通过Smo和Gli1促进成纤维细胞分化为肌成纤维细胞。Moshai等[17]发现，抑制Gli的活性可减缓小鼠肺纤维化，减小肺胶原蛋白的沉积，促进肺组织内抗炎、抗纤维化环境形成。国内研究报道，百草枯可导致SHH途径中Smo、Gli1的表达水平在肺纤维化大鼠肺组织中显著上调[18]。本研究发现，在模型大鼠肺成纤维细胞中，SHH、Smo、Gli-1 mRNA和蛋白的表达水平较对照组显著上调，而白藜芦醇则可以抑制SHH、Smo和Gli-1的表达，结果表明，博莱霉素诱导的肺纤维化过程具有活化成纤维细胞中SHH信号途径的作用；与之相反，白藜芦醇则可以抑制成纤维细胞中SHH信号的活化，下调相关信号蛋白的表达水平。其他研究同样证明白藜芦醇对SHH信号的调控作用。在急性髓系白血病HL-60细胞中，白藜芦醇能够拮抗白介素-6（interleukin-6，IL-6）的作用，降低细胞中SHH和Gli-1的表达，从而抑制细胞生长[19]。本研究还发现，博莱霉素促进成纤维细胞增殖，而白藜芦醇则可以抑制细胞增殖。此外，博莱霉素降低成纤维细胞凋亡，白藜芦醇则促进成纤维细胞凋亡。

综上所述，本研究观察到白藜芦醇可减轻博莱霉素诱导的大鼠肺纤维化，抑制成纤维细胞干细胞SHH信号活化及成纤维细胞增殖，促进细胞凋亡，为明确白藜芦醇在预防和治疗肺纤维化中的作用机制提供实验和理论支持。

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（童颖丹编辑）

Resveratrol inactivates sonic hedgehog signaling and alleviates lung fibrosis in rats

Li-hua Li, Bin Lu, Hong-ke Wu, Hao Zhang, Fei-fei Yao
(Department of Respiratory Diseases, People's Hospital of Zhengzhou, Zhengzhou, Henan 450000, China)

Abstract:Objective To investigate the effect of resveratrol on lung fibrosis in rats.Methods Forty SD male rats were randomly allocated to four groups: control, model, 25-μmol resveratrol and 50-μmol resveratrol groups.Rats in the model group were intratracheally administrated with Bleomycin.Rats in the 25-μmol resveratrol and 50-μmol resveratrol groups were administrated with Bleomycin before intragastric administration of resveratrol.Rats in the control group were administrated with normal saline.After 30 d pathological changes of the lungs in each group were observed and the levels of hydroxyproline(HYP) and typeⅠcollagen were determined.Lung fibroblasts in the rats of each group were isolated and the expression of SHH, Smo and Gli-1 were analyzed by qRT-PCR and Western blot, along with the evaluation of proliferation and apoptosis in these cells.Results The pulmonary alveoli structures of model rats were damaged seriously with the deposition of collagen, while resveratrol attenuated the progression of lung fibrosis.Resveratrol reduced HYP content and typeⅠcollagen expression induced by Bleomycin in the lung tissue.Moreover, Bleomycin significantly upregulated the expressions of Sonic hedgehog(SHH), Smo and Gli-1 mRNAs and proteins, which were inhibited by resveratrol.In addition, Bleomycin enhanced the proliferation and reduced apoptosis of fibroblasts, while resveratrol inhibited fibroblst proliferation and promoted apoptosis.Conclusions Resveratrolbook=36,ebook=41might impede Bleomycin-induced SHH signaling and contribute to the alleviation of lung fibrosis in rats.

Keywords:resveratrol; sonic hedgehog; lung fibrosis; Bleomycin; fibroblast

收稿日期：2015-10-14

文章编号：1005-8982（2016）01-0035-06

中图分类号：R563.9；R332

文献标识码：A