王丽英，文　莉，吕　诚，林　毅，庞代文

(武汉大学生物医学分析化学教育部重点实验室，化学与分子科学学院，病毒学国家重点实验室，高等研究院，武汉430072)



基于宿主细胞中磷脂“自然嵌合”的杆状病毒叶酸修饰

王丽英，文莉，吕诚，林毅，庞代文

(武汉大学生物医学分析化学教育部重点实验室，化学与分子科学学院，病毒学国家重点实验室，高等研究院，武汉430072)

关键词杆状病毒;叶酸;修饰;磷脂;宿主细胞

中图分类号O652

文献标志码A

联系人简介:林毅，女，博士，副教授，主要从事表面分析化学及纳米生物技术研究.E-mail: ylin@ whu.edu.cn

杆状病毒是节肢动物特异性的DNA病毒，具有载体容量大、增殖滴度高、易于大量扩增且对脊椎动物无致病性等优点，在新型基因载体及疫苗开发等方面具有广阔的应用前景［1，2］.然而，杆状病毒缺乏对脊椎动物细胞的靶向性，因此有必要对杆状病毒进行修饰［3～5］.叶酸( FA)是一种人体必需的维生素，具有分子量小、稳定性好、无免疫原性及易于与其它载体或药物键合等优点.由于叶酸受体在多种肿瘤细胞中过度表达，叶酸已成为一种常见的通用型肿瘤靶向分子［6～9］.本文采用宿主细胞中磷脂“自然嵌合”的方法，在细胞培养的同时实现了叶酸修饰磷脂对细胞膜的修饰;利用杆状病毒对该叶酸修饰宿主细胞的侵染及在其中复制的过程，实现了杆状病毒包膜的叶酸修饰.

1　实验部分

1.1试剂叶酸功能化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺( DSPE-PEG2000-FA，美国NANOCS公司) ;胎牛血清( FBS，GIBCO公司) ;草地贪夜蛾( Sf9)细胞购于武汉大学典型物保藏中心;杆状病毒为本实验室构建的在病毒衣壳蛋白VP39上融合了绿色荧光蛋白( GFP)的重组杆状病毒.其它试剂均为分析纯.

1.2实验过程将宿主Sf9细胞在含有0. 03 mg/mL DSPE-PEG2000-FA的细胞培养液中悬浮培养5 d，以感染复数MOI=0. 5接种杆状病毒.当约80%细胞出现明显病变时收取上层清液.将杆状病毒上清液置于50 mL离心管中，在6500 r/mim转速下离心15 min，经0. 45 μm过滤器过滤后超速离心.在离心管底部加入6 mL 25%蔗糖/PBS缓冲溶液作为缓冲垫，缓慢加入初步处理的病毒清液，在22300 r/min转速下离心3 h，弃去上层清液，沉淀用PBS( pH=7. 2)溶解，再次超速离心进行脱糖.

2　结果与讨论

2.1宿主Sf9细胞的叶酸修饰将在含有DSPE-PEG2000-FA的细胞培养液中培养5 d的Sf9细胞接种于共聚焦小皿中，在4℃下与叶酸抗体( anti-FA)孵育过夜.以Dylight488标记的二抗在37℃下孵育并文［10，11］利用生物素化磷脂对细胞膜的“自然嵌合”实现细胞膜结构修饰的报道一致.所用不同浓度的DSPE-PEG2000-FA对Sf9细胞无明显毒性(图2)，因此可用于宿主细胞的修饰.

Fig.1　Bright field images( A，D)，fluorescence images( B，E) and their merge( C，F) of Dylight 488 immunofluorescence labeled Sf9 cells incubated without( A—C) and with( D—F) DSPE-PEG2000－FA modification

Fig.2　MTT assay for the toxicity of different concentrations of DSPE-PEG2000-FA incubated with Sf9 cells

2.2杆状病毒的叶酸修饰如Scheme 1所示，采用杆状病毒对制备的叶酸修饰的宿主Sf9细胞( FA-Sf9细胞)进行感染，细胞病变后收取上层清液并进行分离纯化.由于在所用杆状病毒的基因组中插入了可在病毒衣壳蛋白VP39标记绿色荧光蛋白( GFP)的基因，因此病毒组装后衣壳上可以表达GFP，以便对病毒完整性及叶酸标记效率进行观察.将40 μL纯化后的病毒液滴加到洁净盖玻片上，以Dylight 649标记的叶酸二抗进行免疫标记，置于激光共聚焦显微镜下观察.如图3所示，采用宿主细胞中磷脂“自然嵌合”的方法，可观察到病毒衣壳蛋白VP39上表达的GFP及免疫荧光标记叶酸的信号，且二者共定位效率为( 85. 9±1. 2) %( N=200).此结果表明，采用宿主细胞中磷脂“自然嵌合”的方法可实现杆状病毒的叶酸修饰，且具有较高的效率.

Scheme 1　Schematic illustration of the modification of baculovirus with folic acid( FA) assisted by host Sf9 cells incubated with FA functionalized lipids

Fig.3　Bright field images( A，D)，fluorescence images of GFP( green) labeled and dylight 649( red) inmmunofluorescence labeled FA-baculovirus( B，E) and their merge on glass coverslips( C，F)

由透射电子显微镜( TEM)照片(图4)可见，宿主细胞中磷脂“自然嵌合”修饰的病毒( FA-BV)保持了很好的完整性.采用TCID50测得相同感染复数( MOI= 0. 5)下获得的叶酸修饰病毒的滴度为3. 25× 106TCID50/mL，表明修饰后杆状病毒保持了对宿主细胞的感染能力.

Fig.4　TEM images of BV( A) and FA-BV( B)

综上所述，采用宿主细胞中磷脂“自然嵌合”法实现了杆状病毒包膜的叶酸修饰.该方法利用了叶酸功能化磷脂在细胞膜上的“自然嵌合”过程及杆状病毒在宿主细胞内的自然复制过程，操作简便且最大程度保持了病毒的包膜完整性及感染能力，可基于该方法快速、高效地获得叶酸修饰的杆状病毒.

参考文献

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Modification of Baculovirus with Folic Acid based on Phospholipids Self-insertion in Host Cells†

WANG Liying，WEN Li，LÜCheng，LIN Yi*，PANG Daiwen
( Key Laboratory of Analytical Chemistry for Biology and Medicine，Ministry of Education，College of Chemistry and Molecular Sciences，State Key Laboratory of Virology，the Institute for Advanced Studies，Wuhan University，Wuhan 430072，China)

†Supported by the National Basic Research Program of China( No.2011CB933600)，the National Natural Science Foundation of China ( Nos.21275111，21535005) and the China Scholarship Council( No.201406275115).

Abstract Baculovirus has the advantages such as outstanding biosafety，large cloning capacity and non-replication in the transduced cells.However，their in vivo applications are hampered for lacking of specificity.Therefore，modification of baculovirus with targeting molecules is urgently needed.Herein，a method is proposed for the modification of folic acid( FA) on baculovirus based on phospho-lipids self-insertionin host cells.Immunofluorescent colocalization and transmission electron microscope( TEM) results showed that the modified baculovirus kept their integrity while maintaining their infectivity.Thus the method offers opportunities for the development of tumor-targeting gene vectors and vaccines.

Keywords Baculovirus; Folic acid; Modification; Lipid; Host cell

( Ed.: N，K)

基金项目:国家“九七三”计划项目(批准号: 2011CB933600)、国家自然科学基金(批准号: 21275111，21535005)和国家留学基金(批准号: 201406275115)资助.

收稿日期:2015-11-19.网络出版日期: 2016-01-06.

doi:10.7503/cjcu20150886