鄢洪海,吴菊香,张茹琴,迟玉成,宋希云,夏淑春

(1.青岛农业大学 农学与植物保护学院,山东 青岛　266109;2.山东省花生研究所,山东 青岛　266100)



NO和H2O2在玉米抗弯孢菌侵染中的生理作用机制

鄢洪海1,吴菊香2,张茹琴1,迟玉成2,宋希云1,夏淑春1

(1.青岛农业大学 农学与植物保护学院,山东 青岛266109;2.山东省花生研究所,山东 青岛266100)

摘要：为了明确一氧化氮(NO)和过氧化氢(H2O2)与玉米弯孢菌叶斑病抗性的关系,及作为信号分子调控玉米抵御弯孢菌感染过程中的生理机制。以对玉米弯孢菌叶斑病具有不同抗性的3个玉米种质478、齐319、农大108为试材,外源施用硝普钠(SNP)、2-4,4,5,5-苯-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(cPTIO)、过氧化氢(H2O2)、抗坏血酸(AsA),和接种玉米弯孢病菌,比较植株病情指数、NO和H2O2含量及寄主防御酶活性的变化。结果表明:外施一定浓度的NO供体硝普钠(SNP)和H2O2均可减缓玉米弯孢叶斑病菌侵染进程,降低感病率和平均病情指数,并且能够不同程度地提高植株防御酶活性,尤其抗性弱的玉米种质478植株内过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)和β-1,3-葡聚糖酶(Glu)的活性,诱发了玉米过敏性坏死反应;接种玉米弯孢菌后3个玉米种质叶片中NO和H2O2含量均有猝发现象,而NO和H2O2的清除剂cPTIO和AsA在一定程度上能够提高玉米植株感病率和病情指数。NO和H2O2是玉米弯孢菌叶斑病抗病的重要信号分子,可提高POD、CAT、SOD、PAL和Glu病程相关蛋白活性,进而增强玉米对弯孢菌的抗性。

关键词：玉米弯孢菌;NO和H2O2;寄主防御酶;抗病性生理

玉米弯孢叶斑病(Curvularialunata)是一种玉米叶部上重要病害,20世纪末至21世纪初该病害曾在我国玉米主要产区严重发生,1996年辽宁省发生面积达16.8万hm2以上,部分地区玉米绝收[1]。近几年该病害发生虽有所减轻,但个别地区仍然造成严重的经济损失,并不断从北方向南方蔓延,鉴于该病害的危害和发生特点,1999年四川省将其列为植物检疫补充对象,近2年又在云南省连续严重发生。目前,该病害已经成为继玉米大小斑病后,玉米上又一毁灭性病害[1-2]。由于NO和H2O2是寄主的一个重要信号分子,在抗病生理中发挥重要作用,因此,明确NO和H2O2在玉米弯孢菌叶斑病抗病中的作用及机制对该病害的控制具有重要意义。植物受病原菌侵染时能够通过一系列的信号传导,最终产生某种程度的防御反应,来抵御病害的危害。一氧化氮(Nitric oxide,NO)是植物响应多种生物胁迫的信号分子之一,用真菌激发子处理豌豆叶片时能检测到NO的猝发和对应的抗病反应[3];拟南芥受大丽轮枝菌侵染之后,NO的大量积累并在80 min时出现峰值[4]。过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2) 能在生物细胞代谢过程中产生活性氧,植物细胞在受到病原菌等胁迫时,能激发H2O2的产生,并以此来调控一系列应答胁迫的信号传导,启动寄主的防御反应。Patykowski 和 Urbanek[5]报道H2O2作为第二信使参与了番茄对病原侵染的抗病反应,水稻感染白叶枯病菌后H2O2含量稳定增加,并在6 h时检测到过氧化氢酶相关基因显著地被诱导表达,10 h可达到峰值,抗病品种较感病品种出现的早,生成量高[6]。青岛农业大学植物病理生理学实验室先前研究表明,NO和H2O2参与了玉米抵御弯孢叶斑病菌侵染的过程,初步确认可能是玉米回应弯孢病菌入侵的早期信号物质。但关于NO和H2O2在玉米弯孢菌叶斑病中的抗病生理作用鲜有报道,尚未有玉米弯孢菌侵染与寄主过敏性坏死反应和防御反应机理方面的研究报道。因此，本研究进一步通过外源供给与清除NO和H2O2处理,并挑战接种弯孢菌，来探讨NO和H2O2在玉米弯孢菌叶斑病抗性中的生理作用机制。

1材料和方法

1.1供试菌株及接种植株培养

玉米弯孢菌叶斑病菌CL90023由山东省聊城的玉米弯孢菌叶斑病病株上分离获得(致病性测定结果为强致病性)。

供试玉米种质齐319、农大108、478分别为高抗、中抗和高感玉米弯孢菌叶斑病的品种和自交系,用盆栽方法培育供试玉米植株。

1.2植株处理

取13叶期的玉米植株,分别用毛刷蘸取药液涂抹处理植株的叶片,处理药液H2O2的浓度分别为Ⅰ:0.01%,Ⅱ:0.1%,Ⅲ:1%,硝普钠(Sodium nitroprusside,SNP,NO供体)的浓度为Ⅰ:0.01 mmol/L,Ⅱ:0.1 mmol/L,Ⅲ:1 mmol/L,2-4,4,5,5-苯-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(2-(4-carboxyphenyl)-4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt,cPTIO,NO清除剂)的浓度分别为Ⅰ:0.1 mmol/L,Ⅱ:1.0 mmol/L,Ⅲ:10 mmol/L,抗坏血酸(As-corbic acid,AsA,H2O2清除剂)的浓度分别为Ⅰ:0.2 mmol/L,Ⅱ:2.0 mmol/L,Ⅲ:20 mmol/L,以蒸馏水作为对照组。之后接种玉米弯孢菌,孢子悬浮液的浓度为5×105个/mL,将处理过的植株放置于培养箱中培养,定时取样。培养箱光/暗周期为16 h/8 h,湿度100%,温度28 ℃,每个试验重复3次。

1.3抗感性观测及病情调查

观察并拍照接种后植株叶片的发病情况,根据病斑大小和敏感性确定抗感反应和过敏性坏死反应,并于接种处理后的7 d测量各处理的发病级别和计算病情指数。

1.4NO和H2O2含量测定

NO含量测定采用青岛力冉生物工程研究所提供的试剂盒测定。取0.4 g样品叶片加3.0 mL 0.9% NaCl,研磨成匀浆;10 000 r/min离心10 min,取上清,沸水浴5 min;10 000 r/min离心5 min,取上清,稀释20倍,在550 nm波长下,测定吸光度值。

H2O2含量的测定采用胡林刚等[7]报道的方法进行。

1.5DAB染色

将供试玉米叶片分别用dH2O(对照)、SNP、H2O2、cPTIO、AsA 处理和接种弯孢病菌,48 h后将其浸泡在0.1%DAB染液中,然后抽真空,置于黑暗处室温保存15 h,出现棕色斑后,用60 ℃ 80%酒精脱色,在此期间不断观察过敏性坏死反应。

1.6寄主防御酶活性测定

1.6.1过氧化物酶(POD)活性测定pH值7.2 PBS (磷酸缓冲液) 0.7 mL+酶液0.3 mL+愈创木酚3.0 mL,在470 nm波长下,测定吸光度值。

1.6.2过氧化氢酶(CAT)活性测定取2.9 mL Tris-HCl缓冲液25 ℃水浴,加入50 μL酶液于EP管,快速混匀,倒入比色皿中,封口,预热5 min。加入50 μL 750 mmol/L H2O2并开始计时,每隔60 s读一次OD240值,连续读3次。

1.6.3苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性测定缓冲液2.9 mL+0.02 mol/L苯丙氨酸1.0 mL+酶液0.1 mL,40 ℃水浴中反应10 min,HCl 终止反应,在290 nm 波长下,测定吸光度值。

1.6.4超氧化物歧化酶(SOD)活性测定在装有3 mL反应混合液(在54 mL 14.5 mmol/L DL-甲硫氨酸中分别加入50 mmol/L pH值7.8磷酸缓冲液的3 μmol/L EDTA,2.25 mmol/L NBT和60 μmol/L核黄素各2 mL,各个溶液均在用前配制,避光放置)的试管中,加入1 mL SOD 酶液,混合后放置在试管架上,在光照培养箱内光照10 min,取出试管,迅速测定OD560值,以灭活的酶液作为对照[8]。

1.6.5β-1,3-葡聚糖酶(Glu)活性测定参照栗小英等[9]的方法测定β-1,3-葡聚糖酶活性,以1 min·1 g 鲜组织产生1 μg还原糖的酶量为一个酶活性单位(U)。

2结果与分析

2.1SNP和H2O2诱导的玉米弯孢菌叶斑病过敏性坏死反应及抗病性

玉米弯孢菌侵染玉米叶片2 d后经DAB染色,可见经SNP和H2O2处理的叶片出现不同程度的坏死症状,尤其是经1 mmol/L SNP、0.1% H2O2处理的叶片褐色反应明显,形成较大的褐色圆斑(图1-B、C),而对照清水处理的叶片没发现褐色坏死反应(图1-A)。接种后5 d SNP和H2O2处理的叶片组织变成枯斑,上面不产生分生孢子,对照在接种后5 d可见大量的水浸状斑点(典型的玉米弯孢菌叶斑病症状)。接种后7 d发病情况调查表明经SNP和H2O2处理的叶片与对照组比发病轻(病斑数少,衰老的慢。虽然SNP和H2O2处理的叶片曾出现比对照组病斑大的现象,但病斑以外的健康组织不发黄,也不枯萎,而对照组植株的叶片发黄快,逐渐枯萎,症状严重,图1-D、E),并且在经SNP和H2O2处理的叶片病斑上很少形成分生孢子。另外,经cPTIO、AsA处理的叶片接种后,叶片病情指数比对照有不同程度的增加。以cPTIO 10 mmol/L,AsA 20 mmol/L处理的病情指数最高,症状加重明显,说明抑制或清除叶片组织中的NO、H2O2有促进玉米弯孢菌侵染的作用,对病害发生有利(图2)。

2.2NO和H2O2参与了调控玉米弯孢菌侵染寄主的过程

2.2.1NO含量与弯孢菌侵染和植株抗病性的关系从图3-A可以看出,478、齐319、农大108这3个品种或自交系在接种弯孢菌后,植株体内的NO含量和对照不接种比都发生明显变化。高抗自交系齐319在接种后NO含量快速上升,4 h出现高峰,之后迅速下降,8 h含量比对照还低,并在接种后16 h出现最低值,之后又有升高,但很快又下降,于28 h出现第2个最低值;农大108的变化曲线和齐319相似,但峰值出现晚4 h(在8 h),之后含量不断下降,出现最低值后又有一定的升高;而感病自交系478在接种后就不断下降,于接种后的8,24 h出现2个最低值。另外,对照没接种病菌的齐319、农大108、478植株体内的NO含量虽然都有下降,但曲线变化不明显,说明接种玉米弯孢病菌影响了玉米植株内NO代谢,并且在抗病和感病植株内的变化差异明显,暗示植株内NO含量变化与寄主的抗病性关系密切。

图1　SNP和H2O2诱发的玉米弯

图2　不同处理接种玉米弯孢叶斑

用NO和H2O2处理进一步探讨对植株NO代谢和寄主防御反应的影响表明:外源用NO供体SNP(1 mmol/L)处理及挑战接种弯孢菌能明显提高玉米植株内NO的含量,而用NO的抑制剂cPTIO(10 mmol/L)处理则明显降低了植株内的NO含量;H2O2和AsA处理对植株内的NO的含量虽也都有升高和降低影响,但不如前者明显(图3-B)。结合图1发病情况比较,可知外源NO和H2O2处理都能改变植株内NO含量和植株抗病性。

图3　接种和药剂处理对叶片内NO含量的影响

2.2.2H2O2含量与弯孢菌侵染和植株抗病性的关系从图4-A可以看到,品种中478的H2O2初始含量(以鲜质量计)最高(40 μmol/g),但在接种弯孢菌后0~8 h,478植株内的H2O2含量一直下降,并于8 h降至最低值(第1个低峰),随后H2O2含量上升,于16 h出现最高峰,接着H2O2含量又迅速下降,于20 h出现第2个低峰。而抗病植株齐319和农大108的H2O2含量则都是在0~4 h内快速上升,并于4 h出现第1个高峰,然后都开始下降并于12 h出现最低值,之后又都上升到另一个高峰(16 h);然而,3个没接种病菌的对照植株体内的H2O2含量始终变化不明显,说明H2O2含量变化与弯孢病菌侵染有关,即H2O2参与了玉米植株抗性应答反应。

为了证明上述结果,采用外援施用H2O2和AsA、SNP和cPTIO方法处理寄主,来进一步探究对内源H2O2的影响。从图4-B可以看出,用H2O2及其抑制剂AsA处理能明显提高和降低弯孢菌侵染玉米植株内的H2O2含量,而SNP和cPTIO处理对植株内的H2O2的含量虽也都呈升高和降低趋势,但与H2O2和AsA对植株内H2O2的含量影响相反,可能植株内NO含量的升高反而抑制了H2O2形成。

图4　接种和药剂处理对叶片内H2O2含量的影响

2.3.1NO和H2O2对玉米植株内过氧化物酶(POD)活性的影响从图5-A可以看出,感病自交系478的POD活性(以鲜质量计)在初始阶段较低,并且在接种病菌后呈下降趋势,从接种后8 h开始逐渐升高,到接种28 时达到峰值。而齐319在起始阶段POD的活性就很高,在接种后虽也出现降低,但很快开始升高,在16 h出现一个活性高峰,虽然后来有所下降,出现起伏变化,但接种病菌后总体活性较高,可能与该品种的抗侵染能力有关。农大108也在接种弯孢菌4 h后POD活性下降,随后逐渐升高,就总趋势来说与齐319相似,但活性高峰比齐319出现的晚4 h(即20 h出现活性高峰)。另外,从经SNP和H2O2处理后玉米植株内的POD活性变化曲线看(图5-B),外源用NO和H2O2及NO和H2O2抑制剂处理也能影响玉米植株内POD的活性,尤其在接种玉米弯孢叶斑病菌条件下施用NO供体SNP和H2O2可明显提高POD的活性,在处理的24~36 h内都能出现一个活性高峰。而用NO和H2O2抑制剂处理,植株内POD的活性很快下降,在12 h就出现最低值,说明短时间内可明显降低POD酶的活性。综合图5接种病菌、外源NO和H2O2及抑制剂处理对POD活性的影响,发现初始阶段抗病品种POD活性就比感病品种高,并在受病原菌侵染及NO和H2O2处理后,其活性升高得快,高峰出现的早,峰值大。说明POD是寄主抗病性强弱的一个生理指标,可能通过NO和H2O2信号传导寄主抗性反应,实现寄主防御功能。

图5　接种病菌和NO、H2O2处理对寄主POD活性的影响

2.3.2NO和H2O2对玉米植株内过氧化氢酶(CAT)活性的影响从图6-A可以看出接种前寄主中的CAT活性(以鲜质量计)都很低,在接种后,寄主的CAT活性都随着接种时间的增加而升高,而对照的CAT的活性始终没有明显变化,说明接种玉米弯孢菌激发了寄主CAT活性。并且在接种后的12~16 h,植株中的CAT活性都出现活性高峰,但抗病植株齐319活性高峰出现最早,活性最高,其次是农大108,感病品种478最弱,说明抗病品种活性表达强烈。

另外,用NO供体和H2O2处理玉米叶片也能诱发CAT活性提高,但用H2O2处理对植株内的CAT活性影响最明显,尤其是用病菌加H2O2处理的植株内CAT的活性变化比单独用病菌接种和单独用H2O2处理的活性还明显,并在处理后的12 h出现活性高峰,之后不断下降。而用NO供体SNP和抑制剂cPTIO处理的植株内CAT变化不明显(图6-B)。

图6　接种病菌和NO、H2O2处理对寄主CAT活性的影响

2.3.3NO和H2O2对玉米植株内超氧化物歧化酶(SOD)的影响图7-A可以看出接种弯孢菌后,3个玉米品种中SOD的活性(以鲜质量计)都逐渐升高,而对照都没有明显变化,说明接种病菌诱发了SOD防御酶的活性升高。但抗病自交系齐319活性升高的速度明显快,并在接种后8 h出现活性高峰值,活性最高,而农大108和478的SOD活性峰值出现的相对较晚,尤其是感病自交系478不仅峰值出现晚,活性也最低。虽然SOD在后期都有所下降,但还是比对照活性高,表明处理激发的SOD活性持续时间较长。

另外,从图7-B可以看出,用NO和H2O2处理叶片也能诱发SOD活性提高,处理后的寄主SOD活性不断升高,说明外源施用NO和H2O2与接种病菌对SOD活性的影响有相似效应。但以病菌+NO供体处理对植株内的SOD影响最明显,显示NO处理和接种病菌对SOD的影响有累加效应作用。而NO抑制剂cPTIO和H2O2抑制剂AsA对SOD活性虽有部分降低的影响,但不明显。

图7　接种病菌和NO、H2O2处理对寄主SOD活性的影响

2.3.4NO和H2O2对玉米植株内苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的影响从图8-A可以看出,接种前抗病植株齐319和农大108 PAL的活性(以鲜质量计)比感病寄主478活性高,并且在接种后抗病植株的PAL活性迅速升高,在4 h就出现活性高峰,出现早,活性也极高;而478的PAL活性接种前就很低,虽然接种后有一定的升高,在12 h出现一个活性高峰,但最高值也比抗病寄主低很多。PAL活性是在接种病菌前后,以及抗病寄主和感病寄主之间差异十分明显,这说明PAL是玉米弯孢叶斑病抗性的一个重要指标。

进一步采用外源NO和H2O2及抑制剂处理玉米植株,来探究PAL活性变化的规律和调控的信号物质。结果发现:用NO供体SNP和H2O2处理的玉米植株内PAL的活性增加明显,并以接种病菌+ H2O2处理的组合最明显(图8-B),结果表明:NO和H2O2处理具有与接种病菌对PAL活性影响的同样效应,且有叠加作用。而单独用NO和H2O2抑制剂处理对植株内的PAL活性影响不明显。综合图8结果,表明用弯孢菌、NO供体和H2O2处理都对寄主PAL影响明显,抗病品种活性升高最快、峰值最大,而NO和H2O2抑制剂对植株内PAL的活性影响不明显可能与非病菌胁迫情况下寄主内PAL活性低有关。

图8　接种病菌和NO、H2O2处理对寄主PAL活性的影响

2.3.5NO和H2O2对玉米植株内β-1,3-葡聚糖酶(Glu)活性的影响从图9-A可以看出抗病植株齐319、农大108在接种弯孢菌前β-1,3-葡聚糖酶活性比感病寄主478明显高,在接种后3个寄主内的β-1,3-葡聚糖酶活性都不断升高,在接种后8 h都出现活性高峰,但齐319活性峰值最大;478的β-1,3-葡聚糖酶的活性虽然也出现了高峰,但始终没有达到齐319和农大108接种前的水平。虽然能看出β-1,3-葡聚糖酶活性与寄主的抗病有关,但齐319 β-1,3-葡聚糖酶活性受病菌侵染影响最严重,而农大108和478相对较弱。

另外,用SNP、H2O2、cPTIO和AsA处理对寄主β-1,3-葡聚糖酶影响的变化曲线图看(图9-B),外源NO和H2O2也能诱导寄主β-1,3-葡聚糖活性升高,而抑制NO和H2O2产生也能减弱寄主β-1,3-葡聚糖活性,并且这种调控与玉米植株抵御弯孢菌的侵染有关,说明该酶也是玉米弯孢菌叶斑病抗病生理的一个重要标志,且受植株内NO和H2O2水平调控。

3讨论

寄主受病原生物侵染后,产生的防御反应和抗病性程度,对病害的发生发展至关重要。因此,明确寄主抗病防御反应的作用机理,往往也被看作是有效控制生产上一些重要病害的主要先决条件。有研究报道,NO 和H2O2在植物防卫反应中起重要作用,作为抗病信号网络上的一分子,参与了许多防卫相关基因的表达[10-13],但对 NO 和H2O2参与玉米抗弯孢菌叶斑病防卫反应的分子机制了解甚少。

图9　接种病菌和NO、H2O2处理对寄主β-1,3-葡聚糖酶活性的影响

3.1外源NO和H2O2处理对玉米弯孢菌叶斑病抗病性的影响

有研究表明NO直接参与调节了植物防卫基因活化[14-19]。也有试验证实,NO 协同活性氧(ROS)激发寄主细胞程序化死亡,引起过敏性坏死反应(Hypersensitive reaction,HR)[20-24]。抑制NO的形成导致病原菌侵染能力增强,增加寄主的感病性,也进一步表明NO 的产生对寄主抗病性和HR反应的起始和发展起重要作用[25]。另外,NO和H2O2在激发防卫反应的转录过程中具有互补功能[26-27]。

本研究结果表明,用外源NO和H2O2处理的玉米植株,接种玉米弯孢叶斑病菌诱发了过敏性坏死反应,尤其是用NO处理的植株褐色坏死斑出现得既快又明显;相反,用NO和H2O2抑制剂cPTIO和AsA处理玉米植株则诱发了寄主感染玉米弯孢菌叶斑病。

3.2NO和H2O2直接参与了玉米抗弯孢菌侵染及生理代谢

接种玉米弯孢叶斑病菌能使植株内源NO 和H2O2含量发生猝发现象,抗性强的品种齐319和农大108 猝发早;用NO供体SNP和H2O2处理后的植株抗病性增强,且用NO和H2O2清除剂cPTIO和AsA处理后,玉米严重感病的结果也能进一步表明NO和H2O2是抗病信号分子。

另外,在抗、感植株中,单独施用NO供体能部分抑制H2O2的积累[23]。Beligni和Lamattina[28-29]也报道NO能清除植株体内的活性氧起到抗氧化剂作用,进而抑制H2O2形成,改变了信号途径,但引起细胞死亡。为了明确这一点,用cPTIO处理玉米植株,结果显示抑制NO产生能明显增加H2O2积累,也与王静等[30]报道的结果较一致。

3.3NO和H2O2作为信号分子调控了寄主防御酶活性及抗病性

本研究结果显示,用NO供体SNP和H2O2处理,及接种弯孢菌均能明显提高玉米叶片防御酶(PAL、POD、SOD、CAT、Glu等)活性,病菌接种结果表明，防御酶的活性增加幅度与寄主的抗性呈正相关,暗示增强寄主的防御酶活性就能提高寄主的抗病性,与之前用NO供体和H2O2处理植株的玉米弯孢菌叶斑病发病轻,用NO和H2O2抑制剂处理植株的玉米弯孢菌叶斑病发病重结果相吻合。

但与张少颖等[31]研究结果:NO的产生抑制了月季植株内PAL活性不同,这可能与植物不同、外界胁迫因子不同,导致NO对PAL活性调控的生理机理存在差异有关。玉米受到弯孢菌侵染后,植株可能通过NO和H2O2的积累,来调控POD、CAT、SOD、PAL、Glu等诸多防御酶的活性,进而增强抵御弯孢菌的扩展。另外,也有报道NO和H2O2能诱导谷胱甘肽S-转移酶基因(GST)、查尔酮合成酶基因(CHS)等抗病和防御相关基因的转录,进而增强植物抗性[32]。然而,NO和H2O2是如何调控玉米植株中POD、CAT、SOD、PAL、Glu等几种防御酶活性,以及增强的机制如何尚不清楚,有待进一步研究探讨。

参考文献：

[1]吕国忠,刘志恒,何富刚,等.辽宁省爆发一种新病害-玉米弯孢菌叶斑病[J].沈阳农业大学学报,1997,28(1):80-81.

[2]戴法超,王晓鸣,朱振东,等.玉米弯孢菌叶斑病研究[J].植物病理学报,1998,28(2):28-34.

[3]Srivastava N,Gonugunta V K,Puli M R,et al.Nitric oxide production occurs downstream of reactive oxygen species in guard cells during stomatal closure induced by chitosan in abaxial epidermis ofPisumsativum[J].Planta,2009,229(4):757-765.

[4]Shi F M,Li Y Z.Verticilliumdahliaetoxins-induced nitric oxide production inArabidopsisis major dependent on nitrate reductase[J].BMB Reports,2008,41(1):79-85.

[5]Patykowski J,Urbanek H.Activity of enzymes related to H2O2generation and metabolism in leaf apoplastic fraction of tomato leaves infected withBotrytiscinerea[J].Journal of Phytopathology-Phytopathologische Zeitschrift,2003,151(3):153-161.

[6]Wu Y Q,Luo X M,Duan C J,et al.Determination of elicitation of hypersensitive response on nonhost plants byXanthomonasoryzaepv.oryzae(in Chinese)[J].Guangxi Agric Sic,2007,38(6):631-633.

[7]胡林刚,李渐鹏,李永才,等.外源H2O2处理对马铃薯块茎干腐病的控制及其机理[J].中国农业科学,2013,46(22):4745-4752.

[8]丁海东,刘慧,陈一,等.H2O2和MAPK介导油菜素内酯诱导番茄抗氧化防护酶SOD和CAT的信号途径[J].植物生理学报,2011,47(10):1010-1016.

[9]栗小英,高琳,张艳俊,等.叶锈菌及信号分子诱导小麦TcLr35中β-1,3-葡聚糖酶基因的表达分析[J].中国农业科学,2014,47(14):2774-2783.

[10]Shiloh M U,Nathan C F.Reactive nitrogen intermediates and the pathogenesis of salmonella and mycobacteria[J].Current Opinion in Microbiology,2000,3(1):35-42.

[11]黄贝梅,南志标.NO和H2O2在沙打旺抗黄矮根腐病反应中的互作[J].草业科学,2014,31(6)：1028-1032.

[12]俞禄珍,吴小芹,叶建仁,等.黑松与松材线虫互作早期NO应答信号与外在因子的关系[J].应用生态学报,2013,24(3):646-652.

[13]吴伟华,柳家友,闫海霞,等.夏玉米弯孢菌叶斑病与南方锈病的发生及综合防治[J].河南农业科学,2010,39(11):76-78.

[14]Durner J,Wendehenne D,Klessig D F.Defense gene induction in tobacco by nitric oxide,cyclic GMP and cyclic ADP-ribose[J].Proc Nat1 Acad Sci USA,1998,95:10328-10333.

[15]Klessig D F,Durner J,Noad R,et al.Nitric oxide and salicylic acid signaling in plant defense[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97:8849-8855.

[16]Huang X,Kiefer E,Von R U,et al.Nitric oxide burst and nitric oxide-dependent gene induction in plants[J].Plant Physiol Biochem,2002,40:625-631.

[17]Zeier J,Delledonne M,Mishina T,et al.Genetic elucidation of nitric oxide signaling in incompatible plant-pathogen interactions[J].Plant Physiol,2004,136:2875-2886.

[18]Delledonne M.NO news is good news for plants[J].Current Opinion in Plant Biology,2005,8(4):390-396.

[19]Lamotte O,Courtois C,Barnavon L,et al.Nitric oxide in plants:The biosynthesis and cell signaling properties of a fascinating molecule[J].Plant,2005,221:1-4.

[20]Grun S,Lindermayr C,Sell S, et al.Nitric oxide and gene regulation in plant[J].Exp Bot,2006,57:507-516.

[21]Delledonne M,Zeier J,Marocco A,et al.Signal interactions between nitric oxide and reactive oxygen intermediates in the plant hypersensitive disease resistance response[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:13454-13459.

[22]Murgia I,Tarantino D,Vannini C,et al.Arabidopsisthalianaplants overexpressing thylakoidal ascorbate peroxidase show in creased resistance to paraquat-induced photooxidative stress and to nitric oxide-induced cell death[J].Plant,2004,38:940-953.

[23]Polverari A,Molesini B,Pezzotti M,et al.Nitric oxide-mediated transcriptional changes inArabidopsisthaliana[J].Mol Plant-Micro Inter,2003,16:1094-1105.

[24]Mur L A J,Carver T L W,Prats E.NO way to live;the various roles of nitric oxide in plant-pathogen interactions[J].Exp Bot,2006,57:489-505.

[25]Prats E,Mur L A J,Sanderson R,et al.Nitric oxide contributes both to papilla-based resistance and the hypersensitive response in barley attacked byBlumeriagraminisf.sp.Hordei[J].Mol Plant Pathol,2005,6:65-78.

[26]Zago E,Morsa S,Dat J F,et al.Nitric oxide-and hydrogen peroxide-responsive gene regulation during cell death induction in tobacco[J].Plant Physiol,2006,141:404-411.

[27]Clarke A,Desikan R,Hurst R D,et al.NO way back:nitric oxide and programmed cell death inArabidopsisthalianasuspension cultures[J].The Plant Journal:for Cell and Molecular Biology,2000,24(5):667-677.

[28]Beligni M V,Lamattina L.Nitric oxide counteracts cytotoxic processes mediated by reactive oxygen species in plant tissues[J].Planta,1999,208:337-344.

[29]Beligni M V,Lamattina L.Nitric oxide protects against cellular damage produced by methylviologen herbicides in potato plants[J].Nitric Oxide,1999,3:199-208.

[30]王静,王海霞,田振东.β-氨基丁酸诱导马铃薯对晚疫病的抗性组织化学及信号传导途径分析[J].中国农业科学,2014,47(13):2571-2579.

[31]张少颖,饶景萍,高慧.一氧化氮对切花月季瓶插过程中乙烯合成代谢的影响[J].西北农林科技大学学报:自然科学版,2007,35(11):171-175,180.

[32]Gonzalez-Teuber M,Pozo M J,Muck A,et al.Glu-canases and chitinases as causal agents in the protection of Acacia extrafloral nectar from infestation by phytopathogens[J].Plant Physiol,2010,152:1705-1715.

Regulation Mechanisms of NO and H2O2in Maize AgainstCurvularialunata

YAN Honghai1,WU Juxiang2,ZHANG Ruqin1,CHI Yucheng2,SONG Xiyun1,XIA Shuchun1

(1.College of Agronomy and Plant Protection,Qingdao Agricultural University,Qingdao266109,China;2.Shandong Research Institute of Peanuts,Qingdao266100,China)

Abstract：In order to determine the physiological mechanisms of NO and H2O2in the regulation of maize against Curvularia lunata infection.Three maize germplasm 478,Qi319 and Nongda 108 with different resistant to C.lunata were exogenously treated with sodium nitroprusside (SNP),2-(4-Carboxyphenyl-)4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide potassium salt(cPTIO),hydrogen peroxide (H2O2),ascorbic acid (ASA) and inoculated with C.lunata,then the disease index,NO or H2O2content,and different defense enzymes activity were analyzed.The results indicated that,exogenously treated with NO donor sodium nitroprusside (SNP) or H2O2could slow down the process of C.lunata,reduce the infection rate and the average disease index of the plants,and increase peroxidase (POD),catalase (CAT),phenylalanine ammonia lyase (PAL),superoxide dismutase (SOD) and β-1,3-glucanase activity in maize germplasm 478 plants which have a weak resistance to the pathogen,thus induced a hypersensitive reaction in the maize plants;after inoculation with C.lunata,NO or H2O2content were burst in the leaves of the three maize germplasms,while the scavenger cPTIO and AsA of NO and H2O2could improve the maize infection rate and disease index.Both NO and H2O2are important signals in maize plants,which could improve pathogenesis-related proteins including POD,CAT,SOD,PAL and β-1,3-glucanase activity,and thus enhance the maize resistance against C.lunat.

Key words:Curvularia lunata;NO and H2O2;Host defense enzymes;Resistance physiology

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.026

中图分类号：S435.13

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)01-0162-08

作者简介：鄢洪海(1964-),男,吉林长春人,教授,博士,主要从事植物病理学教学及研究。嫣洪海、吴菊香为同等贡献作者。通讯作者：夏淑春(1963-),女,吉林长春人,副教授,主要从事植物病理学教学与科研工作。

基金项目：山东省科技发展项目(2009GG10009022);山东省自然科学基金项目(ZR2011CL005);山东省“泰山学者”建设工程专项经费(BS2009NY040)

收稿日期：2015-09-11