王晓晔,石博妹,王英群,李　珣,刘徳玉,李　铭,李芳芳,胡传活

(1.广西大学 动物科学技术学院,广西 南宁　530005;2.广西畜禽品种改良站,广西 南宁　530001)



抗凋亡融合蛋白PTD-Bcl-xL原核表达载体的构建及表达纯化

王晓晔1,石博妹1,王英群2,李珣1,刘徳玉2,李铭2,李芳芳2,胡传活1

(1.广西大学 动物科学技术学院,广西 南宁530005;2.广西畜禽品种改良站,广西 南宁530001)

摘要：人工抗凋亡蛋白PTD-Bcl-xL能保护多种因素引起的细胞异常凋亡,为了获得高纯度Bcl-xL与PTD(Protein transduction domains)的融合蛋白,首先采用TRIzol法提取SD大鼠肝脏总RNA,将RNA反转录为cDNA,设计引物以cDNA为模板，PCR扩增Bcl-xL基因,构建pUM19-T-Bcl-xL质粒,并对质粒双酶切鉴定和测序鉴定;其次设计包含PTD序列的Bcl-xL引物,以测序正确的pUM19-T-Bcl-xL质粒为模板，PCR扩增PTD-Bcl-xL序列,将扩增序列克隆入pET28a载体,构建PTD-Bcl-xL蛋白的原核表达质粒pET28a-PTD-Bcl-xL,并对pET28a-PTD-Bcl-xL载体双酶切鉴定和测序鉴定;将pET28a-PTD-Bcl-xL重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,并对IPTG诱导融合蛋白表达的浓度和诱导时间进行了优化;SDS-PAGE分析表达蛋白的可溶性情况,在变性条件下用Ni-NTA琼脂纯化融合蛋白;最后用SDS-PAGE、Western Blot及质谱对融合蛋白进行鉴定。结果表明:双酶切pUM19-T-Bcl-xL质粒出现约774 bp大小条带,pUM19-T-Bcl-xL质粒测序结果与NCBI数据库比对序列一致,表明成功构建pUM19-T-Bcl-xL质粒;双酶切pET28a-PTD-Bcl-xL质粒出现约744 bp大小条带,pET28a-PTD-Bcl-xL质粒测序结果与预期序列一致,表明成功构建了pET28a-PTD-Bcl-xL原核表达载体;在IPTG诱导下pET28a-Bcl-xL重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出36 kDa大小蛋白,最优IPTG诱导浓度为0.1 mmol/L,最佳IPTG诱导时间为6 h;SDS-PAGE电泳显示融合蛋白主要出现在菌液超声后的沉淀里,以包涵体形式表达,经Ni-NTA琼脂纯化获得了高纯度的融合蛋白;Western Blot 和质谱鉴定证明IPTG诱导表达蛋白和纯化的融合蛋白为PTD-Bcl-xL蛋白。……