王　飞,王立广,潘梅瑶,钮中一,周　勇,梁国华

(1.扬州大学 农学院,江苏 扬州　225000;2.江苏武进水稻研究所,江苏 常州　213000)



水稻抗稻瘟病Pigm(t)基因的分子标记辅助选择与利用

王飞1,王立广1,潘梅瑶1,钮中一2,周勇1,梁国华1

(1.扬州大学 农学院,江苏 扬州225000;2.江苏武进水稻研究所,江苏 常州213000)

摘要：旨在快速改良武运粳29196的稻瘟病抗性。采用定向回交育种策略,运用分子标记辅助选择技术和花药培养技术,快速改良武运粳29196的稻瘟病抗性。以籼稻品种谷梅4号为稻瘟病抗性基因Pigm(t)的供体,以高产易感稻瘟病的品系武运粳29196为受体,在连续回交和自交过程中,利用与Pigm(t)紧密连锁的InDels标记S95477和S29742进行分子标记辅助选择。在BC2F1世代,进行花药培养,获得185个双单倍体群体(DH群体),从中筛选出82个含有Pigm(t)基因的改良株系。在经过对农艺性状、稻瘟病抗性的系统鉴定与稻米品质性状测定后,发现改良株系DH036和DH158的综合性状与武运粳29196已十分相近,且稻米品质有所提升,保持了武运粳29196丰产性的同时,稻瘟病抗性有了明显的提高。利用定向回交、花药培养和分子标记辅助选择相结合的技术体系,可明显提高稻瘟病抗性改良的预见性和准确性,缩短育种年限、加快育种进程。新育成的武运粳29196抗性改良系,为稻瘟病抗性育种提供了重要的遗传资源。

关键词：水稻;抗稻瘟病基因Pigm(t);分子标记辅助选择;回交育种;花药培养

稻瘟病是由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的,是水稻生产上最具危害性的三大病害之一[1],其遗传背景十分复杂,生理小种变异也十分迅速,新培育的抗病品种的抗性很难保持[2],再加上环境气候变化的影响,使得稻瘟病的危害范围和程度也越来越重。进入20世纪90年代以来,我国稻瘟病的年发生面积均在380万hm2以上,由稻瘟病引起的水稻减产量占总产的10%~30%左右[3],造成全球水稻产量损失达数亿kg,这些粮食足以养活6 000多万人口[4]。给全球水稻生产量和经济效益发展带来了严重的损失。所以,如何选育出具有持久抗稻瘟病的水稻新品种,是广大育种工作者面临的主要任务之一。

随着科技水平的发展,开发了越来越多的分子标记,其种类和数量都日益丰富,稻瘟病抗性基因的定位及克隆在此基础上得到了迅速发展。稻瘟病抗性基因的精细定位和克隆,是利用抗病基因进行分子标记辅助选择育种的关键工作[5]。如Berruyer等[6]通过抗病品种IR64和易感品种Azucena杂交,经花药培养构建DH群体,结合开发的SSR标记,将抗稻瘟病基因Pi33定位于第8号染色体的短臂上;Deng等[7]通过抗病品种谷梅4号和易感品质Maratelli杂交,将广谱抗性基因Pigm(t)定位于水稻第6号染色体上,将其定位在70 kb区间内,该抗病基因与Pi2、Pi9紧密连锁或等位。通过将MAS技术应用于抗稻瘟病育种,可以将优势基因聚合到一起,实现水稻抗稻瘟病的持久性。本研究利用定向回交、花药培养和分子标记辅助选择相结合的技术体系,改良了武运粳29196对稻瘟病的抗性水平,为稻瘟病抗性育种提供了重要的遗传资源。

1材料和方法

1.1供试水稻材料

抗稻瘟病Pigm(t)基因的供体亲本为谷梅4号(GM4),为四川省农业科学院植物保护研究所选育的籼型常规稻。武运粳29196是江苏(武进)水稻研究所培育的一个优良常规粳稻,株型和产量性状非常突出,但在稻瘟病高发地区表现为高感。本研究以武运粳29196为受体亲本,含有Pigm(t)基因的谷梅4号为供体亲本,构建BC2F1群体,从中选择性状优良且携带抗病基因Pigm(t)的单株作花药培养供体材料。2012年构建70个BC1F1株系。2013年构建199个BC2F1株系,2014年构建185个武运粳29196遗传背景的DH株系。

1.2供试菌株以及接种鉴定

从江苏省不同生态地区分离鉴定的稻瘟病菌中，选择各个生理小种代表性菌株的混合液作为供试菌株，由江苏省农业科学院植物保护研究所及江苏省里下河农业科学研究所提供。

1.3花药培养

在2013年7-8月水稻孕穗期时,从BC2F1群体中选择携带抗病基因且性状优良的植株,按照吴丹等[8]提供的方法进行花药培养。

1.4DNA提取及PCR扩增

在水稻苗期,分别取上述亲本材料和各群体单株的新鲜叶片2 cm左右采用小样CTAB法提取DNA[9]。

PCR 扩增引物采用与稻瘟病抗性基因Pigm(t)紧密连锁的分子标记S29742和S95477,此标记由何祖华实验室开发[7],引物序列为S29742(F):CAGTGAAACGAACGCTATG,S29742(R):AATAGG AAGGGTTGATGTTG;S95477(F):AATTCTTCCACG CCCTAAT,S95477(R):AATAGGAAGGGTTGATGT TG,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

PCR 反应体系为 25 μL,含2 μL DNA模板,2.5 μL 10×Buffer(含Mg2+),2.5 μL dNTP,2 μL 5 pmol/μL 上下游混合引物,0.2 μL rTaqDNA 聚合酶,13.3 μL ddH2O。PCR 反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性40 s,52~55 ℃退火40 s,72 ℃延伸40 s,34个循环;72 ℃延伸10 min,18 ℃保存[10]。最后PCR扩增产物在溴化乙锭染色的3%琼脂糖凝胶中用1×TAE缓冲液以 8~12 V/cm的电压进行电泳,利用Bio-Rad凝胶成像系统拍照并分析带型[11]。

1.5田间试验与农艺性状考种

2013年冬季,将花培苗移栽于海南省陵水县扬州大学南繁育种基地。于2014年4月收获花培苗自交种子,5月分别种于扬州市槐泗镇试验基地和淮安市洪泽县江苏油田农工商公司钻井农场。其中,在扬州试验基地,每个株系种10行,每行10株,武运粳29196也按照同样的规格种植作为对照。田间管理按当地丰产标准,只防虫不防病。在洪泽县江苏油田农工商公司钻井农场,每个DH系种植20行,每行10株,武运粳29196作为对照,按同样的规格种植。

在水稻孕穗期时,于扬州试验基地进行人工接种试验。采用活体穗苞注射接种法:选取稻穗仍未露出但即将破胸的苞穗,用注射器注入1 mL的各菌株混合液,在每个株系上注射5根稻苞[12]。按孙漱沅等[13]于黄熟期调查病情及划分抗性:0级(HR):无病;1级(R):每穗损失5%以下(个别枝梗发病);2级(MR):每穗损失20%左右(1/3左右枝梗发病);3级(MS):每穗损失50%左右(穗颈或主轴发病,谷粒半瘪);4级(S):每穗损失70%左右(穗颈发病,大部瘪谷);5级(HS):每穗损失100%(穗颈发病,造成白穗)。在江苏油田农工商公司钻井农场种植的群体,进行自然发病调查,每个株系选取50株统计发病单株数,重复2次。

在水稻成熟期,于洪泽湖油田农场进行农艺性状考种,选取中间一行的中间5株考察其株高、有效穗数、穗粒数、千粒质量、穗长及剑叶长等农艺性状[14]。并且每个株系随机选取50株进行测产,进而测得平均单株产量。

1.6稻米品质性状测定

以洪泽湖油田农场收获的小区稻谷为材料,测定出糙率、精米率、整精米率、垩白粒率、垩白度、长宽比等碾磨品质和外观品质,按农业部部颁标准《优质稻谷 GB/T17891~1999》测定糙米率、整精米率、碱消值等理化指标。RVA 谱特征值主要包括最高黏度(Peak viscosity,PKV)、热浆黏度(Hot pasteviscosity,HPV)、冷浆黏度(Cool paste viscosity,CPV)、崩解值(Breakdown,BDV)、消减值(Setback,SBV)和回复值(Consistence,CSV)等。

2结果与分析

2.1分子标记鉴定结果

分子标记S95477检测表明,2012年获得的70个BC1F1株系中有33个含有Pigm(t)基因,在该位点杂合。检测2013年获得199个BC2F1株系中有69个含有Pigm(t)基因,在该位点杂合。分子标记S29742检测表明,2014年获得的185个武运粳29196遗传背景的DH株系中有82个含有Pigm(t)基因,且在该位点纯和,有1个株系在该位点为杂合,可能是因为播种时人工混杂造成,如图1。得到的DH株系有44.32%的纯合株系含有Pigm(t)(表1)。

A.武运粳29196;B.谷梅4号。

世代Generation总检测株数TotalNo.ofplanttested携带抗病基因Pigm(t)植株数No.ofplantwithresistancegenes携带抗病基因植株所占比例/%PercentageoftheplantwithresistantgeneWuyunjing29196/GM4BC1F1703347.14Wuyunjing29196/GM4BC2F11996934.67DH(BC2F1)1858244.32

2.2DH系的稻瘟病抗性的鉴定结果

在扬州市槐泗镇试验基地进行人工接种稻瘟病菌条件下鉴定稻瘟病抗性,在洪泽县江苏油田农工商公司钻井农场进行自然诱发条件下鉴定稻瘟病抗性。结果如表2所示,结合DH株系的株高和孕穗期,从82个含有抗病基因Pigm(t)的株系中筛选出21个DH株系,其穗瘟抗性高于对照系武运粳29196(图2)。表2的数据为平均值。

2.3DH系的农艺性状调查结果

所得21个DH株系农艺性状良好且稻瘟病抗性高,以武运粳29196作为对照,考察和比较DH及对照的孕穗期、株高、穗长、穗粒数、单株产量、千粒质量及剑叶长等农艺性状。结果表明,DH036、DH158这2个株系在单株产量上略高于对照武运粳29196,穗粒数低于对照武运粳29196,说明这2个DH株系基本保持了武运粳29196的特性(表3)。

表2　部分DH株系及对照对稻瘟病的抗性表现

图2　两个改良系(DH)及对照(CK)的抗病表现

株系Line穗数PNP千粒质量/gGW穗粒数GNP单株产量/gYP株高/cmPH穗长/cmPL剑叶长/cmSWLDH03611.624.38194.3**40.34*92.9*17.822.3DH15811.425.01178.0**36.65108.217.924.0CK10.023.59230.436.16105.418.725.3

注：*和**分别表示在0.05和0.01水平上显著。

Note:*and**indicate significant difference at the 0.05 and 0.01probability levels,respectively.

2.4DH系的稻米品质性状检测结果

表4中列出了2个DH株系及对照武运粳29196的碾磨品质、外观品质和RVA谱特征值。各改良系的出糙率、精米率均无显著差异;2个改良系的整精米率都极显著高于武运粳29196;DH158的米粒长宽比高于对照武运粳29196,偏长粒(图3)。RVA谱特征值尤其是回复值、消减值和崩解值能够较好地反映水稻品质间蒸煮食味品质的差异[15],隋炯明等[16]研究认为,RVA谱特征值中崩解值高,消减值、回复值低的品种类型,其米饭软而黏、有弹性、适口性好;而崩解值低,消减值、回复值高的品种类型,米饭硬而黏性小,适口性差。从表4中的RVA谱特征值来看,DH158这个改良系的崩解值高于对照武运粳29196,冷浆黏度、回复值、消减值低于武运粳29196,有可能食味品质好;综合比较DH036改良系各品质性状参数,都与武运粳29196相似,该系具备武运粳29196的大部分特质。RVA谱特征值只能作为评价品种蒸煮食用品质的一个参考,从RVA谱特征值尚难判断改良系食味品质的优劣,可通过扩大鉴定范围,进行食味品评确定[17]。

表4　两个改良系(DH)及对照(CK)的品质性状

注：*.显著高于或低于CK;**.极显著高于或低于CK;BRR.出糙率;MRR精米率;HRR.整精米率;AR.长宽比;CP.垩白粒率;CH.垩白度;PKV.最高黏度;HPV.热浆黏度;CPV.胶黏度;BDV.崩解值;SBV.消减值;CSV.回复值;AVS.碱消值。

Note:*.Significantly higher or lower than CK at 0.05 probability level;**.Significantly higher or lower than CK at 0.01 probability level;BRR.Brown rice rate;MRR.Milled rice rate;HRR.Head rice rate;AR.Aspect ratio;CP.Chalky grain rate;CH.Chalkiness;PKV.Peak viscosity;HPV.Hot paste viscosity;CPV.Cool paste viscosity;BDV.Breakdown viscosity;SBV.Setback;CSV.Consistence;AVS.Alkali spreading value.

图3　两个改良系(DH)及对照(CK)的田间形态与外观品质

3讨论与结论

纵观世界各国水稻育种技术的发展过程,从一开始的纯系育种技术发展到品种间杂交育种技术,后来又研究出亚种间杂交育种技术及理化诱变育种技术,这是水稻品种改良技术的变革历程[18]。最近几十年来,随着分子生物学和生物技术的快速发展,分子标记、转基因技术和基因组科学的发展对水稻遗传育种工作影响深远,在许多方面已经改变了传统水稻育种观念和育种手段[19-20]。本研究利用分子标记辅助选择育种和花药培养技术这种新的育种方法和新的理论体系,从分子层面上优化设计优良品种。

本研究注重理论与生产实践的紧密结合,目的是对高产粳稻品种武运粳29196的稻瘟病抗性进行遗传改良以提高其抗病性。武运粳29196为受体亲本,谷梅4号为抗病基因Pigm(t)的供体亲本,通过杂交和回交,以及利用与稻瘟病抗性基因紧密连锁的标记S95477和S29742进行辅助选择,对武运粳29196改良系的鉴定结果表明,其稻瘟病的抗性都有了明显提高。说明利用分子标记辅助选择聚合抗稻瘟病基因的方法,作用于水稻品种稻瘟病抗性改良是有效、可行的,也证实了基因Pigm(t)的抗病效果是非常有效的。

本研究在选育抗稻瘟病水稻品种的同时,兼顾了农艺性状与稻米品质的选拔,注重分子标记选择与常规育种手段的结合,努力使抗性、产量与品质达到同步改良。对改良系进行稻瘟病抗性鉴定的同时,也对其稻米品质进行检测,筛选农艺性状好、稻米品质优的品系。

分子标记辅助选择在快速筛选含有目的基因的株系上相较于传统表型选择的方法,其效率较高[21],将分子标记与花药培养方法相结合,找到其间的最佳结合点,才能达到既加快育种进程又降低劳动强度和费用的理想效果。本试验采用分子标记、回交育种及花药培养相结合,将基因Pigm(t)导入武育粳29196,获得与轮回亲本相似的纯合抗病单株。

对于武运粳29196的抗稻瘟病改良,目前完成了一个抗病基因Pigm(t)的导入,已经取得了较理想的结果。通过杂交、回交、分子标记辅助选择和花药培养相结合构建DH群体,2014年正季对DH株系进行了稻瘟病接种试验，检测DH株系对稻瘟病的抗性情况,同年进行了农艺性状及品质性状的测定。在185个DH株系中,笔者筛选出82个含有抗性基因Pigm(t)的株系,经过后续田间表型鉴定及稻瘟病抗性鉴定后,得到2个单株产量高于武运粳29196抗病性明显提高的株系。在经过品质性状测定后,从中又选出一个品质性状较好的株系DH158和一个农艺性状与对照武运粳29196完全相似的抗病株系DH036。这2个改良株系综合性状与武运粳29196已十分相近,保持了武运粳29196丰产性的同时稻瘟病抗性又有了明显的提高,达到了预期目标。

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Marker-assisted Selection and Application of Blast Resistant GenePigm(t) in Rice

WANG Fei1,WANG Liguang1,PAN Meiyao1,NIU Zhongyi2,ZHOU Yong1,LIANG Guohua1

(1.Agricultural College of Yangzhou University,Yangzhou225000,China;2.Wujin Rice Research Institute,Changzhou213000,China)

Abstract：This study was aimed to improve the resistance of Wuyunjing 29196.Blast resistant gene Pigm(t) showed a broad spectrum of strong resistance.Wuyunjing 29196 is an excellent conventional Japonica rice,which has good yielding but sensitive to rice blast.This study was aimed to improve the resistance of Wuyunjing 29196 to blast by MAS and anther culture.GM4,a variety carrying a resistant gene Pigm(t),was used as the donor parent.Two closely linked InDel markers,S95477 and S29742,were employed to select the Pigm(t) gene in each generation.Finally,185 DH (Double haploid) lines were developed from the anthers of BC2F1plants.Among them,82 improved lines with homozygous Pigm(t) were selected.Multiple agronomic traits including grain yield and resistance to rice blast and the rice quality were characterized.Two fine lines,DH036 and DH158 screened out,finally which had increased resistance level and enhanced yield production.More importantly,they had similar plant architecture and other traits.Simultaneously had high resistance to rice blast and quality.The combination of anther culture and marker-assisted selection successfully improved the resistance to rice blast,in a short breeding period.The improved Wuyunjing 29196 with high blast resistance level provided important genetic resources in breeding.

Key words:Rice;Pigm(t);Marker assisted selection;Back cross breeding;Anther culture

doi:10.7668/hbnxb.2016.01.009

中图分类号：Q78

文献标识码：A

文章编号：1000-7091(2016)01-0051-06

通讯作者：周勇(1983-),男,江苏泗洪人,副教授,博士,主要从事水稻遗传育种研究。

作者简介：王飞(1992-),男,江苏连云港人,在读硕士,主要从事水稻遗传育种研究。梁国华(1965-),男,江苏盱眙人,研究员,博士,主要从事水稻遗传育种研究。

基金项目：国家“973”项目(2013CBA01405);国家自然科学基金项目(31100863;31271679);江苏省普通高校专业学位研究生科研创新计划项目(SJLX_0612)

收稿日期：2015-12-04