循环肿瘤细胞检测技术研究进展

张国瑞1张忠献2曹风雨2刘红1杨晓乐1张业鹏1

(1.郑州大学第一附属医院 呼吸与危重症二科二病区河南 郑州450052； 2.郑州大学 基础医学院河南 郑州450001)

【关键词】循环肿瘤细胞；检测；肿瘤

2015年2月4日，CA期刊在线发布了《2012全球癌症统计》的全文。基于GLOBOCAN估计，2012年全球有1.41千万新发癌症病例，820万患者死于癌症。其中57%的癌症患者以及65%的癌症死亡患者来自于发展中国家。根据对全国肿瘤登记中心2011年监测数据分析，中国肿瘤登记中心2015年报发布我国当年新增癌症病例337.2万，癌症死亡病例221.3万，相当于每分钟就有6.4个人罹患癌症。其中结直肠癌、男性前列腺癌、女性乳腺癌、甲状腺癌、宫颈癌发病率持续上升；食管癌、胃癌、肝癌发病率下降，但肺癌发病率和死亡率变化不大。肺癌发病率在我国男性患者中居第1位，在女性患者中居乳腺癌之后，死亡率均居第1位，5年生存率为16.1%，其中因远处转移而死亡的患者比例超过90%[1]。

1循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)概述

尽管经典理论认为在病情进展至晚期才会出现恶性肿瘤的转移和复发，但实际上在早期就已发生了肿瘤细胞的播散。早在1869年，Ashworth在1位因癌症死亡患者的循环血液中发现一种类似于尸检组织样本中发现的肿瘤细胞，CTCs的概念从而被首次提出[1]。目前，CTCs被定义为自发或因诊疗过程中由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。其中多数的肿瘤细胞进入循环系统后将被机体的免疫系统识别并清除，但是少量肿瘤细胞将演进并获得新的特征，从而在血液中存活，这些细胞即CTCs，甚至于进一步聚集形成微小癌栓—循环肿瘤微栓(circulating tumor microemboli，CTM)，其成分可能包括癌细胞、成纤维细胞、白细胞、内皮细胞及血小板等。相对于单个癌细胞，CTM在一定条件下更容易发展为转移灶[2]。

CTCs在恶性肿瘤发生发展进程中均可以被检测到，包括在临床确诊前[3]。近年来关于各种实体瘤的研究和治疗技术不断提高，很多患者在手术等治疗后虽未被检测到残留的肿瘤病灶，但最终却因肿瘤复发和转移而死亡。这可能与临床判定标准有关，其中最重要的即影像学技术。很多情况下并不能检测到微小的残留肿瘤细胞，这些细胞存在于外周血、骨髓中，在一定条件下能够再次增殖、浸润，引起肿瘤复发、转移。同样，在肿瘤患者早期未形成可被影像学检测到的可视病灶前，外周循环血液中同样可发现CTCs的存在。在肿瘤的发生发展过程中检测CTCs不但有助于早期诊断，监测复发、转移，而且在治疗过程中可根据CTCs的变化判定疗效及预后。进一步对CTCs进行分子生物学分析，可以制定个体化的治疗方案[4]。尤其需要注意的是，随着基因组学研究及对肿瘤标志物表达、缺失、差异性表达研究的深入，科学家们发现，由于受肿瘤异质性的影响，临床组织活检虽起到确诊及指导用药的目的，但单次组织活检可能会造成分子标志物分析的偏差，在肿瘤的进展过程中更加明显，然而实时活检在临床上难以被患者接受。因此，通过对CTCs分子特征及突变的分析将会促进更多分子标志物的发现及药物的开发，对于CTCs单细胞的进一步研究将使我们有可能对肿瘤的生物学行为、疾病进展及转移过程有更深入的认识[3]。

2CTCs检测方法

尽管研究人员已经在多种类型的实体瘤患者的外周血中发现CTCs，但CTCs的数量相对来说还是非常稀少的，要在数以百万计的白细胞中检测出CTCs，就如同大海捞针一般，并非是件容易的事情。对于CTCs的检测，目前多数研究建立在富集的基础上[5]，而对CTCs的富集主要是依据不同种类血细胞的物理特征(如大小、密度、电荷等)及生物学特征(如细胞表面蛋白等)的差异[6]。富集分离方法主要包括以免疫学为基础的检测技术、非标记检测技术、以生物物理特性为基础的检测技术等。

2.1以免疫学为基础的检测技术免疫学富集技术是通过抗原抗体反应标记细胞从而达到富集作用，在此技术基础上与免疫磁珠、微流控设备等相结合从而开发出多种检测系统。免疫磁珠技术是在细胞表面抗原与免疫磁球特异性单抗结合的基础上，于外加磁场的作用下吸附复合物，达到富集的目的。这是一种使用最普遍的检测方法。根据标记的靶细胞是否为CTCs分为阳性富集及阴性富集两大类。阳性富集方法即以免疫方法标记CTCs的方法达到富集检测的目的。市场上已有多种应用本原理的检测设备，如CellSearch系统、CTC-Chip、免疫磁性细胞分选仪(MACS)、RARE Cell、Adnatest癌细胞检测系统等[7]。CellSearch系统是目前惟一被美国食品药品监督管理署(FDA)批准进入临床的检测方法，用于预测转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的无进展生存时间(progression-free survival，PFS)和总存活时间(overall survival，OS)，通过强力磁体将上皮黏附因子(epithelial cell adhesion molecule，EpCAM)阳性的CTCs从血液样本中富集出来，证明其为上皮来源的细胞，然后通过对细胞角蛋白(cytokeratin，CK)8、CK18、CK19、CD45和DAPI进行免疫荧光染色，证明其为非白细胞及有核细胞，系统扫描分析后筛选CK阳性的细胞供检测者判读，符合肿瘤细胞形态且CK+、DAPI+、CD45-的细胞被定义为CTCs。应用该方法发现，非小细胞肺癌患者Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期阳性率分别为36%、45%、40%[8]。尽管CellSearch系统目前被认为是精准度较高的一种检测方法，但是在炎症性疾病等非肿瘤疾病患者外周血中可发现假阳性结果的存在，更重要的是该方法的富集效率并不尽如人意。原因不难理解，尽管EpCAM被认为是目前最优的上皮来源肿瘤细胞的特异性抗原，但深入的研究发现，在肿瘤发生转移前，原发肿瘤细胞通常会在其微环境的影响下经历一种被称为上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的改变，不仅细胞形态和移动性改变使其容易释放及转移，细胞基因表达谱特别是上皮抗原向间质性表型转变，此时的癌细胞表面EpCAM往往是不表达的，从而导致以EpCAM为基础的CellSearch系统富集效率欠佳，加之该检测费用较高，使其在临床上广泛应用受到限制。

Adnatest系统是通过免疫磁珠技术富集CTCs，继以RT-PCR技术检测肿瘤细胞特异性表达的mRNA，从而达到检测CTCs的目的[8-12]。其可对乳腺癌、前列腺癌、结肠癌及卵巢癌患者的CTCs进行基因表达分析。尽管此方法灵敏度较高，但它是建立在这些核酸来源于CTCs的假设的基础上。另外，由于核酸的半衰期不稳定，检测到的可能只是游离的核酸而非CTCs，且部分核酸为坏死肿瘤细胞分解所释放，易于出现假阳性结果，并且无法摆脱核酸检测技术进行后续分析的缺陷。

微流控技术是一种针对极小量(10-9～10-18L)流体进行操控的系统科学技术，微流控芯片以微流控技术为基础，使得其容纳流体的有效结构(通道、反应室和其他某些功能部件)至少在1个维度上为微米级尺度。近年来，纳米技术和微流控技术的结合使得CTCs捕获效率更高。CTC-chip系统是以微流控设备为基础，包含包被抗EpCAM抗体的微型柱，在层流的条件下捕捉CTCs[13-14]。Zhang等[15]设计了一种微流体芯片共培养模型，检测效率达到68%，在富集CTCs的基础上还可以进行扩增培养，进而进行基因检测、侵袭实验、高通量测序等后续研究。一些基于微流控芯片的CTCs分离体系也逐渐被研制出来，比如一种肿瘤细胞表面特异性识别抗体功能的鱼骨形芯片(HB-chip)[16]。该芯片通过通道内鱼骨形沟回引起血液的一个轻微涡旋，增强抗原与抗体的接触。相对于CellSearch检测系统，该技术无需对血液样品进行预处理且灵敏度高。另外，将微流控与免疫磁珠相结合的检测技术还有Ephseia[17]、isoFlux(Fluxion)[18]、LiquidBiopsy(Cynvenio)[19]等。

流式细胞技术(flow cytometry，FCM)是利用流式细胞仪进行的一种单细胞定量分析和分选技术。ImageStream(Amnis)系统首先将荧光特异性抗体与肿瘤细胞特异性抗原结合，通过流式细胞仪对荧光信号的分析从而鉴别CTCs[20]。该方法的优点是不仅可以定量检测CTCs，而且可以对CTCs多种参数(大小形态、细胞类型、存活状态、细胞内外标记物)进行分析，更容易鉴别真正的阳性细胞，但检测灵敏度较低，在外周血中寻找相对稀少的CTCs比较耗时。

阴性富集法也是检测CTCs的常用策略。与阳性富集不同的是，免疫磁珠标记的抗体是能与大多数白细胞结合的抗CD45抗体，通过磁珠结合不需要的细胞而获得分离出来的CTCs。类似的检测方法还有Quadrupole magnetic separator[21]。

外周血中的单个核淋巴细胞和CTCs的密度与其他血液细胞的密度不同，在此物理特征基础上建立了密度梯度离心技术，通过淋巴细胞分离液进行梯度离心富集单个核淋巴细胞和CTCs，从而达到富集CTCs的目的。在此技术基础上与免疫学技术相结合建立了免疫梯度离心技术(RosetteSepTM)，利用单抗混合物使非靶细胞与全血中的多个红细胞交联，从而增加非靶细胞的密度，最后通过密度梯度离心去除非靶细胞，从而提高CTCs富集的效率。

2.2非标记检测技术膜过滤法主要基于肿瘤细胞的尺寸一般较大的特点(平均直径超过8um)[22]。ISET(isolation by size of epithelial tumor cells)技术，主要是利用肿瘤细胞直径一般大于正常细胞的物理特性来分离CTCs[23]。将血液通过孔径为8 μm的滤膜过滤，正常细胞滤过而CTCs聚集于滤膜上，从而达到富集作用。然而，外周血中单核细胞大小跨度较大，直径可达17 μm左右[24]。因此，此方法不仅可能会漏掉直径较小的CTCs，更可能捕获较大的白细胞，从而使得其灵敏性及特异性下降[25]。此外，以细胞大小为基础的检测系统还有CellSieve[26-27]、Parylene filter[28-29]、SceenCell[30]。微流控与过滤通道相结合的检测装置也获得了应用，通过对肺癌细胞系及肺癌临床样本的检测证明这种基于CTCs大小的过滤微流体芯片相对于抗体依赖性检测有更高的捕获效率。目前，商业化的检测设备有ClearCell FX、Vortex等。但由于CTCs大小和变形性等异质性，此类非标记捕获技术很难有统一的检测流程和质控标准。

2.3基于生物物理学特性的检测技术相对于外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，CTCs在形态学及介电性能上有着本质的不同。介电性能与细胞的直径，细胞膜面积、密度、导电率及体积等有关。ApoCell的ApoStream利用该特性在微流控通道上通过介电电泳场流分离的方法达到分离CTCs的目的，其特点是无需考虑EpCAM的表达，适用于后续的分析、培养等[31]。Silioon Biosystems的DEPArray同样基于此生物物理学特性，可以分离单个CTC进行进一步的分析[32-34]。

2.4直接影像技术流式细胞术与免疫细胞化学技术结合检测CTCs要求细胞流速较低，外周血中白细胞数量巨大，对于检测相对较少的CTCs过于耗时而繁琐。通过光纤阵列扫描技术(fiber optic array scanning technology，FAST)可以以快于普通电子显微镜500倍速度扫描，从而明显提高检测效率，但该方法操作复杂，价格昂贵，临床应用受限[35]。

2.5其他检测方法此外，还有基于CTCs功能性实验达到鉴别的方法。如EPISOT技术通过抗CD45抗体阴性选择除去白细胞后进行短期的细胞培养，通过对不同的标志物进行免疫荧光染色鉴别分泌的蛋白，从而达到鉴定CTCs的目的，其可能对CTCs形成肿瘤转移复发机制的研究具有重要意义[36]。

近年来出现了一种称为活体流式细胞仪的生物医学光学仪器-PAFC技术[37]，将活体实时高速影像方法与体外流式细胞术结合起来，通过激光检测一段时间内通过血管某处横截面的带有荧光标记的肿瘤细胞，可以检测整个循环血的CTCs并进行计数，从而提高灵敏度，无需对患者抽血，可尽量避免抽血时CTCs从实体瘤间断释放带来的影响。

Kojima等[38]报道了一种新型的检测有活性CTCs的方法。该研究团队构建了一种端粒酶特异性的选择性复制的腺病毒(OBP-401)。该病毒载体用人端粒酶逆转录酶基因的启动子(hTERT-p)调节腺病毒感染与复制，并在病毒的E3区插入由CMV启动子调控的绿色荧光蛋白(GFP)基因。该病毒选择性感染外周血中活的、高表达端粒酶的肿瘤细胞，并在肿瘤细胞中复制，使得绿色荧光蛋白随着病毒的复制而高表达，让我们通过普通的荧光显微镜就可以在大量的白细胞中比较容易地找到发出绿色荧光的肿瘤细胞。由于只有活细胞才能感染病毒并支持病毒复制，故通过该方法发现的肿瘤细胞应该是能在外周血中较长时间生存的活细胞，这种活CTCs的检出对于判断预后、评价疗效等临床关心的问题应该更具有参考价值。Kim等[39]通过采用这种新型方法检测早期及晚期乳腺癌患者的CTCs，同时与CellSearch检测结果进行对比，发现二者在阳性率方面差别不大。

3展望

CTCs检测方法近年来发展很快，但是仍有很多问题亟待解决。建立一系列规范的检测流程和评价标准，提高特异性及灵敏性，能够进行后续CTCs分析仍是临床应用的关键。目前，世界上大多数研究集中于CTCs的计数以及其临床指导价值。但这些也许仅仅是“冰山一角”，CTCs检测不仅可以作为一种“液体活检”，更可以在目前研究的基础上进行单个CTC的分子生物学特征分析，发现特异的靶点，用于指导个体化靶向治疗、帮助理解肿瘤细胞异质性等，这些均将成为肿瘤的基础研究及临床应用的有益探索。

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(收稿日期：2015-10-26)

【中图分类号】R 73-3

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.03.036

通讯作者：刘红，E-mail: liuhong925@126.com。