王心淼,郜青叶,金子夜，马大光，焦雪琴，狄旭

(内蒙古医科大学附属人民医院眼科，呼和浩特 010020)



·论著·

糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的Fas、P53基因表达

王心淼,郜青叶,金子夜，马大光，焦雪琴，狄旭

(内蒙古医科大学附属人民医院眼科，呼和浩特 010020)

[摘要]目的探讨糖尿病性白内障及老年性白内障晶状体上皮细胞(LEC)的凋亡与Fas、P53基因的关系。方法在白内障超声乳化手术中取糖尿病性及老年性白内障患者的晶状体前囊膜标本45例，应用光镜，电镜观察LEC的凋亡情况，应用RT-PCR定量检测Fas蛋白，P53蛋白在白内障LEC中的表达。结果两种白内障LEC中均有Fas，P53蛋白表达。Fas蛋白在糖尿病性白内障LEC中的表达平均是老年性白内障的13.34倍，P53蛋白在糖尿病性白内障LEC中的表达平均是老年性白内障的7.3倍，两者差异有统计学意义(P<0.05)。结论两种白内障LEC均出现凋亡，Fas、P53基因在糖尿病性白内障LEC凋亡中起重要作用。

[关键词]糖尿病并发症/白内障 ；上皮细胞/晶体；凋亡诱导因子；基因,p53

晶状体上皮细胞(LEC)是晶状体前囊膜的单层上皮细胞,是晶状体内代谢最活跃的部位,担负着晶状体的生长、分化及损伤修复,在保护整个晶状体的透明性和内环境稳定上起着重要作用[1-3]。Li等[4-6]于1995 年提出晶体细胞凋亡是非先天性白内障的共同基础。一旦由于某些原因，如氧化作用、紫外线照射、Ca2+增高、血糖增高等因素损害了晶状体上皮细胞的正常结构和功能，就可能导致晶状体上皮细胞凋亡。我们对糖尿病性白内障晶体上皮细胞光镜及电镜的微观研究及Fas、P53基因蛋白方面研究，从分子生物学角度研究糖尿病性白内障的防病机制。

1 对象与方法

1.1研究对象收集2012年5月至2014年5月在我院行白内障超乳手术的白内障患者43例(45眼)，其中糖尿病患者22例(23眼)，年龄53～85岁，平均年龄(70.0±4.3)岁，糖尿病病史5年以上(合并视网膜增殖性病变3例)大于白内障病史。入院前内科已确诊为2型糖尿病，术前空腹血糖控制在8.3 mmol/L以下，尿糖转阴。老年性白内障21例(22眼)，年龄55～82岁，平均年龄(68.5±2.7)岁，排除其他眼疾引起白内障的因素，白内障术前诊断标准：视力小于0.4(裸眼、矫正)，晶状体混浊(核2～4级)，在“超乳”手术中由同一位术者完成连续环形撕囊取得中央部晶状体前囊膜标本，直径>5 mm。将糖尿病性和老年性白内障患者的晶体前囊膜标本各5例做RT-PCR监测，其余样本做光镜及电镜检测。

1.2方法

1.2.1光镜标本制作取下晶状体前囊膜标本，缓冲液冲洗干净，平铺于载玻片，滤纸吸除水分，干燥5 min，10%中性甲醛固定1 h，苏木素伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.2电镜仪器 H-700H日本日立透射电子显微镜。

1.2.3 RT-PCR定量检测主要仪器及试剂：涡旋振荡仪QL-902，离心机Centrifuge 5415D，分光光度计NANODROP 2000，荧光定量PCR仪ABI7500。TRNzol总RNA提取试剂，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR® Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus),ROX plus，DL2,000 DNA Marker，引物合成。

把晶状体前囊膜标本放入已预冷的研钵中进行研磨，待组织样本呈粉状后加入Trizol总RNA提取试剂保存5 min加氯仿0.2 mL，用力震荡，离心管充分混匀，室温下放置5～10 min，用Trizol法提取总RNA，采用Nanodrop2000紫外分光光度计测量RNA纯度及浓度，然后采用PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA反转录，将各样品cDNA十倍稀释后取2 μL做模板分别用于目的基因引物和内参基因引物进行扩充，同时在60～95 ℃进行溶解曲线分析，取5 mL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶自动成像仪保存图像并定量分析，根据Real Time PCR原始检测结果按照2-△△Ct相对定量计算公式计算出各样品的目的基因相对定量结果即其他各样品相对于对照样品的基因mRNA转录水平的差异。

2结果

2.1光镜和电镜下显示光镜下观察糖尿病性白内障部分LEC呈透明样变性细胞颜色变淡，细胞内可见空泡，细胞密度较老年性白内障明显下降，同Struck等[7]结果一致，凋亡细胞、变性细胞较老年性明显增多。电镜下两种白内障患者LEC细胞形态大小不一，以扁平状为主，内质网空泡变性，核固缩，胞浆浓缩，核膜皱褶呈不规则形，染色质分布不均匀，凋亡细胞与晶体囊膜结合疏松，有部分脱离。糖尿病性白内障LEC中可见凋亡小体，白内障LEC中未见到凋亡小体，糖尿病性LEC凋亡情况比老年性白内障更为严重。

2.2各样品RealTimePCR检测结果及分析计算出各样品的目的基因相对定量结果，即其他各个样品相对于对照样品，目的基因mRNA转录水平的差异，结果数据见表1。

表1　Real Time PCR检测相对定量结果

注：以糖样本为对照样本

3讨论

本实验电镜下观察到凋亡细胞体积缩小变形大多呈扁平状，与晶体囊膜脱离，与周围细胞间隙增大，线粒体肿大，细胞密度增加，核质浓缩，染色质分布不均，可见凋亡小体。糖尿病性白内障LEC细胞凋亡情况比老年性更为严重。

Fas、p53蛋白在促进白内障晶体上皮细胞凋亡中起重要作用，目前LEC导致白内障的发生已是人们关注的热点，但从客观上来说，对细胞凋亡过程中信号传递系统的认识还不够全面，比较清楚的通路有细胞凋亡的膜受体通路，细胞色素C释放和Caspases激活的生物化学通路。Fas是一种跨膜蛋白，与天然配对的Fasl结合，首先Fasl诱导受体三聚体化，然后再细胞膜上形成凋亡诱导复合物，内含带有死亡结构域的Fas相关蛋白FADD，它是死亡信号转录中的一个连接蛋白，由两部分组成，C端(死亡结构域即DD结构域)和N端(DED，死亡效应结构域)，DD结构域负责和Fas分子胞内段上的DD结构域结合，再以DED和Caspases8原域中的DED相互作用，聚合多个Caspases8分子，该分子随由单链酶原转化成有活性的单链蛋白Caspases，它作为酶原被激活后，可直接破坏细胞结构。灭活或者下调与DNA修复相关的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交联蛋白，由于这些蛋白功能被抑制，使细胞的增值与复制受阻并发生凋亡[8]，国内于永斌等[9]与国外Okamura等[10]比较了年龄相关性白内障和糖尿病性白内障晶状体上皮细胞的凋亡情况发现在有增殖性视网膜病变 (DR)的囊膜样本中，TUNEL阳性细胞的百分比明显高于年龄相关性白内障组。P53为肿瘤抑制基因，野生型p53对细胞凋亡具有激发作用,而突变型p53则有抑制细胞凋亡的作用。在正常组织中野生型p53蛋白表达水平很低,当DNA损伤后,p53基因激活,p53蛋白增多,以终止细胞增生,使损伤DNA得以修复,保持细胞基因组的完整性;如果DNA修复失败,p53蛋白持续升高,便可引起细胞凋亡当 p53基因发生突变时 ,突变的 p53蛋白不能引起细胞增殖的停滞或凋亡 ,导致细胞生长失控 ,肿瘤发生[11-12]。如表1中RT-PCR检测结果所示，Fas蛋白与P53蛋白在两种白内障中均可检测到，糖尿病性白内障LEC中Fas蛋白相对定量平均是老年性白内障LEC中的13.22倍，p53蛋白在糖尿病性白内障LEC中的相对定量平均是老年性白内障LEC中的7.3倍，差异有统计学意义(P<0.05)，提示Fas与p53基因介导的细胞凋亡在白内障的形成中起着重要作用，电镜下也证实糖尿病性白内障的凋亡情况比老年性白内障更为严重。

由于糖尿病性白内障形成的影响因素很多，本实验结果提示我们糖尿病性白内障LEC发生凋亡的过程中房水中血糖升高可能有促进Fas、P53蛋白介导细胞凋亡的因素，如果这一因素被发现，就可以抑制Fas、P53蛋白介导细胞凋亡，减少和预防白内障的发生。

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Diabetic cataracts cataract lens epithelial cell apoptosis and the expression of Fas,P53 geneWangXinmiao,GaoQinmiao,JinZiye，MaDaguang,JiaoXueqin,DiXu(DepartmentofOphthalmology，theAffiliatedPeople’sHospitalofInnerMongoliaMedicalCollege，Huhhot010020，China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the relationship between lens epithelial cells (LEC) apoptosis of the diabetic cataract and senile cataract and Fas,P53 gene.MethodsAnterior lens capsules specimens 45 cases were took from diabetic and senile cataract patients in the cataract ultrasonic emulsification operation,using light and electron microscopic to observing apoptosis of LEC,and applying RT-PCR to detect quantitatively expression of Fas protein and Bax protein in cataract LEC.ResultsTwo kinds of cataract in the LEC had both protein expression of Fas and P53.Fas protein expression in diabetic cataract LEC was 13.34 times in senile cataract.P53 protein expression in diabetic cataract LEC was 7.3 times in senile cataract,there were significant differences (P<0.05).ConclusionFas and P53 genes may play an important role in cataract LEC apoptosis.

[Key words]Diabetes complications/cataract；Epithelial cells/lens,crystalline；Apoptosis inducing factor；Genes,p53

(收稿日期：2015-06-11)

Corresponding author:Jin Ziye,Email：jinziye1978@126.com

中图分类号:R587.26

文献标识码:A

DOI:10.3969/J.issn.1672-6790.2016.01.012

作者简介：王心淼，主治医师，Email: 1977king@163.com通信作者：金子夜，医师，Email:jinziye1987@126.com

基金项目:内蒙古科技厅2011年度自治区应用研发资金计划(20110501)